猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒Nsp2基因缺失株Jiangxi-3灭活疫苗免疫效果评价

将猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因缺失株Jiangxi-3的第9代病毒(Jiangxi-3F9)按常规方法制成油佐剂灭活疫苗,经肌肉注射免疫PRRSV和猪圆环病毒(PCV2)抗原与抗体均为阴性的60日龄健康猪,免疫组分别于初次免疫第21和28天、二次免疫第28天(即初次免疫第28天加强免疫1次)用200LD50的Jiangxi-3 F9进行攻毒,同时各组均设立对照组。通过试验动物体温变化、临床症状、血清PRRS抗体和抗原定期检测结果评价灭活疫苗的免疫效果。结果表明,初次免疫第21和28天免疫组攻毒后体温仍然明显升高,而二次免疫第28天免疫组攻毒后体温升高不明显,最高体温约40℃。初次免疫21-28 d免疫组特异性抗体水平持续升高,初次免疫第21天与第28天抗体水平差异显著(0.01<P<0.05);二次免疫后免疫组抗体水平仍持续升高,第28天可达3.105±0.125,二次免疫第28天与初次免疫28天抗体水平差异显著(0.01<P<0.05)。初次免疫第21天和第28天免疫组攻毒后仍能在血清中检出PRRSV抗原,仍表现不同程度的临床症状,而二免第28天的免疫组攻毒后其PRRSV抗原检出率、发病率、死亡率均为0。表明初次免疫第28天加强免疫一次比免疫一次效果好。

伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)某些生物学特性研究

本试验测定了伪狂犬病ｇＥ－／ｇＩ－／ ＴＫ－／ ＬａｃＺ＋基因缺失疫苗株（ＳＡ２１５）的致细胞病变效应、安全性、免疫原性和免疫期等生物学特性。试验结果显示，该疫苗株能在Ｖｅｒｏ细胞上适应生长，并形成典型的蚀斑。其对１日龄仔猪、怀孕母猪、牛、羊以及家兔安全，无不良接种反应，接种动物不向体外散毒。ＳＡ２１５疫苗接种猪能抵御高剂量（１０７ＰＦＵ）Ｆａ株强毒感染，攻毒后试验猪的发热期、增重受阻天数、散毒滴度均低于Ｂａｒｔｈａ株疫苗接种猪，远远低于对照组猪。ＳＡ２１５接种猪能维持长时间的高水平中和抗体滴度，免疫期可达半年以上。试验结果表明，ＳＡ２１５株是一株安全、免疫原性好、免疫期长的疫苗株。

伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)生物学特性研究

测定了伪狂犬病gE-/gI-/ TK-/ LacZ+基因缺失疫苗株(SA215)的致细胞病变效应、安全性、免疫原性和接种动物抗体消长规律等生物学特性。试验结果显示,该疫苗株能在 Vero细胞上适应生长,并形成典型的蚀斑。其对1日龄仔猪、妊娠母猪、牛、羊以及家兔安全,无不良接种反应,接种动物不向外散毒。SA215 疫苗接种猪能抵御高剂量(107 PFU) Fa株强毒感染,攻毒后试验猪的发热期、增重受阻天数、散毒滴度略低于 Bartha株疫苗接种猪,低于对照组猪。SA215接种猪能维持长时间的高水平中和抗体滴度。试验结果表明,SA215 株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2基因缺失株RT-PCR检测方法的建立

为了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)nsp2基因缺失流行株,在对不同PRRSV分离株nsp2基因核苷酸序列分析的基础上,设计了针对nsp2基因的1对兼并PCR引物和1条基因特异性反转录引物。RT-PCR试验结果表明,经典PRRSVS1毒株和高致病性nsp2缺失株SY0608毒株的PCR扩增片段的大小分别为768 bp和678 bp。特异性试验和敏感性试验证明,该检测方法特异性较好,但敏感性相对较低,可用于快速鉴别诊断PRRSVnsp2基因缺失毒株和经典PRRSV毒株。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒Nsp2基因缺失株Jiangxi-3毒力的进一步研究

通过Reed-Muench法检测从江西发生持续高热的病猪体内分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因缺失株Jiangxi-3第9代(Jiangxi-3F9)的病毒滴度;将此毒株接种于PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原与抗体均为阴性的60日龄健康猪进行猪半数致死量(LD50)的测定,并且对LD50试验中存活下来的试验猪再次进行较大剂量的攻毒试验,另将病毒接种于PRRSV和PCV2抗原和抗体均为阴性的6月龄健康猪,对所有攻毒试验猪通过体温检测、临床症状观察、RT-PCR、ELISA等方法进一步研究Jiangxi-3F9的毒力。结果表明:Jiangxi-3F9的病毒滴度为105.25TCID50·mL-1,Jiangxi-3F9病毒的LD50为102.·2mL-1。动物试验各项检测结果说明Jiangxi-3F9毒力强。

猪伪狂犬病三基因缺失疫苗(SA215株)的免疫效果观察

进一步验证伪狂犬病三基因缺失疫苗SA215株通过肌肉注射接种后对妊娠母猪、育肥猪、仔猪的安全性和生产成绩。试验证实：仔猪免疫后生长良好，未观测到仔猪出现体温升高：呼吸道症状和消化道症状；母猪免疫后能提高产仔成绩（窝平均成活数高2．98头）和成活率平均为97．36％；对70日龄商品猪免疫接种后，经过近100d育肥，其出栏重增加20．83％；发生伪狂犬病的猪场猪肌注本品48～72h后能控制疾病的发生。

伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究

对PrVEaTK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明,该基因缺失疫苗105 0TCID50和106 0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的,并可保护妊娠母猪抵抗107 1TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后,gE鉴别ELISA试验表明,PrVEaTK-/gE-/gI-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以105 0TCID50和106 0TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物,结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象,说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。

含绿色荧光蛋白基因和猪瘟E_2基因的伪狂犬病毒Bartha-K_(61)株TK基因缺失转移载体的构建

提取伪狂犬病毒 ( PRV) Bartha- K6 1 株基因组 DNA为 PCR扩增模板 ,并根据 Genbank已发表的 PRV Kaplan株 UL区 UL2 5、U L2 4、U L2 3、U L2 2基因序列 ,选择保守序列设计了两对引物 ,这两对引物分别扩增出位于 UL2 3( TK)两侧 (含部分TK基因 )的可用于同源重组的左臂片段 ( L )和右臂片段 ( R) ,L包括部分 UL 2 5、全部 UL 2 4、部分 TK,R包括部分 TK及部分U L2 2 ,L 和 R的拼接片段中 TK基因内部缺失 2 70个核苷酸。将 L 片段和 R片段克隆于 p Bluescript M13-载体上 ,获得p SKL R;再将绿色荧光蛋白载体 p EGFP- C1上含 GFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入 p SKL R的 L 片段和 R片段之间构成转移载体 p SKL KG;又将猪瘟病毒 1.2 3 kb的 E2 ( CSFV- E2 )基因片段插入 p SKL RG的多克隆位点的 Bg1 与 Pst 之间获得转移载体 p SKL

布鲁氏菌M5-90ΔvirB2基因缺失株免疫小鼠抗体及相关细胞因子的检测研究

对构建的M5-90ΔvirB2基因缺失株进行免疫原性初步研究。分别用1×106 CFU剂量的M5-90ΔvirB2株与M5-90疫苗株接种BALB/c小鼠,SAT试验和RBPT试验验证体液免疫产生的抗体水平;用ELISA方法检测小鼠外周血细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α。结果表明,抗体水平检测结果显示M5-90ΔvirB2弱于M5-90;细胞因子检测水平显示M5-90ΔvirB2也低于M5-90。本研究为布鲁氏菌疫苗株M5-90的改造奠定了基础,并提供了相关的理论依据。

1株NSP2蛋白5个氨基酸缺失的PRRSV遗传进化分析

【目的】研究新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况。【方法】提取PRRSV感染病猪肺脏RNA,通过RT-PCR方法对PRRSV NSP2部分基因和ORF5基因进行扩增、克隆和测序,分析其分子变异特征。【结果】成功克隆到1株PRRSV,命名为XJzx1株,其NSP2基因编码蛋白第472~476位存在5个氨基酸的连续缺失,有别于高致病毒株第482、533~561位30个氨基酸的典型缺失,位于经典毒株HB-2(sh)/2002第471~482位12个氨基酸缺失区域内;XJzx1与HK13株NSP2部分基因核苷酸序列相似性最高,为87.5%,系统进化树分析显示,XJzx1株与我国高致病毒株JXA1、HUN4、SX2009等同属一个分支;XJzx1 ORF5基因与我国经典毒株CH-1a、BJ-4、HK6等同属一个分支,其GP5蛋白不存在氨基酸的缺失或插入,而表现为多位点的突变。【结论】PRRSV XJzx1株具有独特的遗传进化特征,其毒性较经典毒株有所加强,推测为新型变异株。

通过滴鼻免疫途径应用NSP2基因缺失蓝耳病疫苗防控蓝耳病的应用体会

猪场蓝耳病的防控策略是先母后仔,母仔一体化。从减少或杜绝母猪的垂直传播开始,种猪和仔猪同时进行免疫。在小猪确诊有蓝耳病感染的紧急情况下,使用基因缺失疫苗进行滴鼻免疫有一定的效果。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的主要病原。PRRS是以妊娠母猪流产、产死胎、产木乃伊胎和弱仔等繁殖障碍及各生长阶段猪的呼吸道病症状和高死亡率为特征的传染病。

伪狂犬病病毒变异株的致病性、分子特征及基因缺失疫苗的研制

仇华吉研究员首先介绍了伪狂犬病的基本情况和危害,他介绍说伪狂犬病是一种严重危害养猪业的一种烈性传染病,感染宿主广泛,除了人和马都可感染此病,不同日龄的猪均可感染,可造成严重的经济损失.

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。

猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

猪链球菌溶血素(SLY)是较早确定的猪链球菌毒力因子之一,具有细胞毒性,在猪链球菌致病过程中发挥重要作用。利用同源重组技术成功构建了猪链球菌2型(SS2)sly基因缺失的突变株SS2-Δsly,缺失株的体外溶血活性消失,对小鼠脑血管内皮细胞的细胞毒性显著低于亲本菌株(P<0.01),但不影响猪链球菌2型在巨噬细胞中的存活。该菌株可以用于研究SS2溶血素在感染细胞中的作用机制。

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。

应用CRISPR/Cas9系统构建大肠埃希氏菌irp2基因缺失株

CRISPR/Cas9是一个新兴的基因编辑技术,利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中的irp2基因进行编辑,为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础。首先构建靶向irp2基因的sgRNA,PCR扩增上、下游同源臂,利用重叠PCR技术连接sgRNA与上、下游同源臂,再通过酶切与酶连构建出靶向irp2基因的pTargetF重组质粒。将pCas与pTargetF重组质粒转化临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中,成功构建了该菌株的irp2基因缺失菌株,为进一步研究其致病机制奠定基础。

猪伪狂犬病病毒双基因缺失突变株(HB-98株)安全性、稳定性和免疫原性测定

对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株（PrV HB-98株）的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明，PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50／0．1mL以上，与亲本毒株相当，但高于Bartha株；与PrV鄂A株相比，病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB／c小鼠的死亡，毒力也低于Bartha株；将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次，各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增，未出现毒力回复现象．表明该毒株具有良好的遗传稳定性；以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔．仔猪也未出现任何临床症状，证明该毒株有较好的安全性。另外，以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，分别于接种后28d和20d，用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击．结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击．获得保护，表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明，PrV HB-98株可以作为候选毒株．用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。

1株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因缺失毒株的基因组特征与演化分析

为了解陕西猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,对发病猪场进行PRRSV分离,采用RT-PCR方法对分离株NSP2基因和ORF5基因分别进行扩增,测序后进行序列分析。结果显示:得到1株PRRSV,命名为HZ1007株,属于美洲型;其NSP2 481位和533—561位存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV分子特征相似;GP5 85—95位氨基酸处出现了11个氨基酸的连续缺失;系统进化分析发现HZ1007与国内高致病性代表毒株HUN4、JXwn06、SY0608等亲缘关系较近,且与HUN4株相似性最高,为97.4%。本研究发现了GP5缺失型PRRSV,这在国内外尚属首例,且HZ1007株与高致病性PRRSV亲缘关系较近,在系统进化分析树上与高致病性毒株同属一个分支,其可能是高致病毒株新的变异型,其致病性和生物学特性需进一步研究分析。

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制——耐药株外膜蛋白OprD_2缺失

目的;研究铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制。方法:以亚胺培南为代表,应用十二烷酸磺酸钠－聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)外膜蛋白图谱、凝胶分光光度扫描分析方法,分别研究临床分离的铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株和亚胺培南敏感株。结果:耐药组OprD2相对含量显著低于敏感组。结论:OprD2的缺失是铜绿假单胞菌对以亚胺培南为代表碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。

源于亲本株PRV Fa的3个基因缺失病毒株PRV TK^-、PRV gE^-/gI^-和PRV TK^-/gE^-/gI^-抵抗强毒攻击的比较研究(英文)

目的4周龄仔猪24头随机分成4个组(A、B、C和对照组),前3组中各5头分别对应接种对应的缺失毒力基因TK(A)、缺失毒力基因gE/gI(B)和缺失毒力基因TK/gE/gI(C)3个基因缺失株,接种剂量均为105PFU,留1头不接种作为同居猪。免疫14d后以107PFU PRV Fa株滴鼻攻毒所有试验猪,7d后屠宰猪只,采集大脑、小脑、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、扁桃体、下颌淋巴结和三叉神经节,用光镜和电镜技术观察PRV攻毒后仔猪的器官损伤程度。收集免疫接种后3d内和强毒攻击后5d内的所有猪只鼻腔拭纸,以Southern blots方法测定PRV的组织分布情况。结果表明,收集的10种组织中出现病变的组织比例分别为:对照组为9/10,免疫A组为4/10、B组为3/10、C组为4/10。病理学和超微病例观察表明,对照组和A组中肺脏损伤严重,其他组轻微;对照组中大脑、小脑、三叉神经损伤严重,免疫组轻微;A、B和C疫苗株对潜伏感染的主要靶器官扁桃体损伤程度依次加重。Southern blots分析表明,所有接种缺失病毒的试验猪均可通过鼻腔分泌物散毒,但是排出的病毒不能成功感染同居猪;A、B和C疫苗株免疫后均不能有效阻止PRV Fa攻击后的散毒,但在仔猪大脑和小脑中不能检出病毒。结论接种3个不同基因缺失株A、B和C均能阻止强毒株Fa感染后向大脑和小脑的入侵,并减少强毒对多个器官的损害作用,其中C株的抗强毒感染能力和抗强毒所致损伤能力更佳。