淋球菌外膜蛋白NspA基因重组子的构建与表达

目的构建淋球菌标准株外膜蛋白NspA基因重组子,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达外膜蛋白NspA。方法提取淋球菌标准株基因组DNA,PCR扩增其NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c(+)中,构建pET-NspA重组子,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和WesternBlot检测表达蛋白。结果成功构建了淋球菌标准株的pET-NspA大肠杆菌表达重组子,经IPTG诱导表达后,该蛋白在大肠杆菌中高效表达。结论淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中的成功表达,为研究该蛋白的免疫学性能、制备抗体和研制预防淋病的疫苗奠定了基础。

脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因重组乳酸菌表达载体的构建及原核表达

用NcoⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒pMD-18T-NspA及可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的载体质粒pW425et,将NspA基因与pW425et表达载体用T4DNA连接酶相连,构建出重组质粒pW425et-NspA,将其转入至E.coliDH5α感受态细胞中,筛选阳性重组子进行SDS-PAGE和Western-blot检测,经蛋白电泳可见约18 kD的融合蛋白,Western-blot分析表明该蛋白具有与脑膜炎奈瑟氏菌抗体的反应原性。

淋病奈瑟菌标准株外膜蛋白NspA基因重组质粒构建和生物信息分析

[目的]研究淋病奈瑟菌标准株(NG 29403和NG 29400)外膜蛋白NspA基因和NspA融合蛋白结构特点,为淋病奈瑟菌疫苗靶蛋白的选择提供依据。[方法]PCR扩增淋病奈瑟菌标准株NG 29400和NG 29403 NspA基因,与表达质粒pET-30c(g+)构建重组子NspA-pET-30c(+),阳性克隆子经双酶切鉴定后进行基因测序。以生物软件对NspA基因进行生物信息分析,并在线预测其蛋白质结构。[结果]成功构建NspA-pET-30c(+)重组质粒,双酶切获得0.5kb和5.4kb预期产物。基因序列分析表明淋病奈瑟菌NspA基因有较高同源性,两标准株与GenBank已有序列均有98%同源性,且与脑膜炎奈瑟菌NspA基因高度近似。蛋白预测显示NspA融合蛋白有40%以上为环状结构,可能为主要功能区。三级结构与脑膜炎奈瑟菌NspA相似。[结论]淋病奈瑟菌NspA基因具有高度保守性,与脑膜炎奈瑟菌NspA基因同源性高,蛋白结构相似,有望成为淋病奈瑟菌疫苗的候选抗原。

脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因的克隆及序列分析

为了获得脑膜炎奈瑟氏菌(Nesseria meningitidis,Nm)表面蛋白A(NspA)基因,从脑膜炎患者的血液中分离出脑膜炎奈瑟氏菌并对其进行鉴定,然后根据NspA基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)技术体外扩增得到NspA基因,进行克隆、测序及序列分析。结果显示,其核苷酸序列同源性与Genbank报道的标准菌株相比同源性为100%。克隆获得的基因保持了脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白NspA基因的完整性,保留了其抗原性,为以后进一步开发脑膜炎基因工程疫苗奠定了实验基础。

脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NspA基因重组的构建和表达

目的构建脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NspA基因重组子,实现其在大肠杆菌的高效表达。方法提取脑膜炎奈瑟菌标准株基因组DNA,PCR扩增NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c中,构建pET-NspA重组子,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,镍琼脂糖凝胶纯化NspA融合蛋白。结果获得了脑膜炎奈瑟菌NspA基因的表达重组子,得到NspA诱导表达蛋白并进行了初步纯化。结论成功构建了脑膜炎奈瑟菌NspA基因的表达重组子,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为研究该蛋白的免疫学性能、制备抗体和研制预防脑膜炎的疫苗奠定了基础。

从负载铁的P204-Nspa煤油溶液中反萃铁

对负载铁的P204[二(2-乙基己基)磷酸]-Nspa磺化煤油溶液中铁的反萃过程进行了研究。考察了反萃剂种类、反萃剂浓度、反萃时间、反萃温度、反萃转速和反萃相比O/A(有机相与水相的体积比)等对铁的反萃率的影响。结果表明:以14 mol/L磷酸为反萃剂,反萃时间为50 min,反萃温度为303 K,反萃转速为200rpm,反萃相比O/A为1∶1时,铁的反萃率可达85.56%。反萃后得到的萃取剂仍具有较优的萃取性能,可循环利用。

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础。用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pEG30a中,转入BL21中表达。经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了ltB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达。ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础。

LTB-NspA融合基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建融合基因LTB-NspA的原核表达载体。方法:用PCR法从淋球菌和大肠杆菌标准株分别扩增出NspA和LTB基因,用重组PCR法通过接头将LTB与NspA融合,将其插入pET-30 a中,并进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:经PCR、酶切和测序分析,证实成功构建了LTB-NspA的原核表达载体。结论:LTB-NspA原核表达载体的成功构建,为研制淋球菌高效粘膜免疫疫苗奠定了基础。

淋球菌NspA核酸疫苗小鼠体内诱生保护性抗体研究

目的进一步研究前期构建淋球菌NspA真核细胞表达质粒pcNspA作为淋病核酸疫苗的可行性。方法将pcNspA分别通过肌内注射(IM)、滴鼻(IN)和阴道接种(IVAG)等3种途径免疫BALB/c小鼠,对免疫鼠的血清、支气管肺泡和阴道洗液等样品分别用间接ELISA检测淋球菌特异性抗体的类型和效价,比较不同接种途径刺激小鼠体内特异性抗体水平的差异以及相应抗体的体外溶菌活性。结果 pcNspA质粒经滴鼻免疫和肌内注射均可在小鼠体内诱导产生较高的特异性体液免疫水平,尤其是滴鼻免疫途径不仅可诱生较高水平的血清IgG抗体(1∶1600),而且在支气管肺泡洗液和阴道洗液中均可检测到特异性sIgA的存在。而阴道接种pcNspA质粒仅能在阴道局部检测到较低水平的特异性sIgA。用pcNspA质粒诱生的血清IgG抗体做体外溶菌活性实验,证实滴鼻免疫小鼠血清具有溶菌活性。结论淋球菌NspA基因疫苗可在小鼠体内诱导产生特异性抗体,并对机体有免疫保护作用;滴鼻可能是淋球菌NspA核酸疫苗的一个有效接种途径。

淋病奈瑟菌NspA基因疫苗诱导小鼠特异性体液免疫应答

1999年Martin等首先克隆了淋病奈瑟菌表面蛋白A（Neisseria surface protein A，NspA）基因，发现其在细胞表面持续表达，菌株之间NspA氨基酸序列的同源性高达98％，提示NspA可能是研制淋病疫苗的理想抗原。我室已成功构建NspA真核表达载体pcNspA，本文研究了pcNspA基因免疫在小鼠体内诱生特异性抗体的作用。

淋病奈瑟菌NspA原核表达及其抗原性研究

目的研究淋病奈瑟菌表面蛋白A（NspA）的抗原性及其在淋病快速诊断技术中的应用价值。方法用PCR技术克隆淋病奈瑟菌NspA基因，构建其原核表达载体，在大肠杆菌中表达重组NspA，表达产物复性后免疫小鼠，Western blot、ELISA分别检测免疫血清与淋病奈瑟菌细胞裂解液中NspA及与淋病奈瑟菌全细胞的结合能力。结果NspA基因可在大肠杆菌中表达，纯化并复性的重组NspA（rrNspA）可在小鼠体内刺激产生高效价特异性抗体，抗rrNspA抗体可与淋病奈瑟菌完整细胞及细胞裂解液中NspA特异性结合。结论获得的rrNspA及抗rrNspA抗体在建立淋病奈瑟菌抗体或抗原快速检测方法中具有潜在的应用价值。

淋病奈瑟菌表面蛋白A真核表达载体的构建及表达

目的构建淋病奈瑟菌外膜蛋白———奈瑟菌表面蛋白A(neisseria surface protein A,NspA)的真核表达载体并使其在真核细胞中表达。方法用PCR方法扩增NspA基因,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1(+)/NspA。以脂质体法转染RAW264.7和COS-7细胞,用RT-PCR检测NspA mRNA的水平,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果扩增的目的基因包括了全段NspA基因,长度约525bp。以脂质体转染RAW264.7和COS-7细胞后,用RT-PCR和免疫组化染色法检测表明,细胞可转录和表达NspA。结论成功构建了重组真核表达载体pcD-NA3.1(+)/NspA,并在真核细胞中得到表达,为研究此蛋白的免疫原性以及淋病基因疫苗的研制提供了物质基础。

淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表达和免疫原性鉴定

目的克隆并构建淋病奈瑟菌表面蛋白A(nspA)基因原核表达系统,并对重组产物rNspA进行免疫原性鉴定。方法采用PCR扩增nspA基因,构建nspA基因原核表达系统。SDS-PAGE检测目的重组蛋白rNspA表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rNspA,免疫双扩散试验及Western Blot鉴定rNspA的免疫原性。结果克隆的nspA基因与GenBank中相关序列相似性为100%,rNspA表达量为细菌总蛋白的40.1%,提纯的rNspA在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。rNspA抗血清免疫双扩散效价为1∶4,rNspA抗血清能有效识别rNspA。结论所构建的nspA基因原核表达系统能高效表达rNspA,表达的产物有良好的免疫原性,为淋病奈瑟菌免疫疫苗的研制奠定基础。

奈瑟氏淋球菌表面蛋白A基因克隆及在真核细胞中的表达研究

为了研制奈瑟氏淋球菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(NeisseriasurfaceProteinA ,NspA)的核酸疫苗 ,根据淋球菌NspA的基因序列 ,设计一对寡核苷酸引物。以淋球菌WHO A菌株基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增获得具有完整开放读码框架 (ORF)的NspA基因 ,并将其正向插入真核表达载体pCMVscript,成功构建了表达NspA基因的真核细胞表达载体pcNspA。用脂质体包裹pcNspA重组质粒转染COS细胞 ,以间接免疫荧光分析法分析NspA基因的表达 ,发现转染pcNspA的COS细胞能高表达NspA抗原。淋球菌免疫保护性抗原NspA基因的克隆与真核细胞表达 。

脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A的克隆表达及血清学分析

目的构建并表达功能性的脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A(NspA)的重组蛋白,并检测流行性脑脊髓膜炎(流脑)恢复期患者血清中的抗NspA抗体水平,探讨NspA作为新的流脑抗原疫苗的意义。方法从流脑患者流行株中克隆NspA基因构建原核表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,GSTrap FF亲和层析纯化出具有生物活性的NspA融合蛋白。采用纯化得到的NspA融合蛋白检测流脑恢复期患者血清中的抗NspA抗体。结果成功表达了功能性NspA蛋白,相对分子质量(Mr)为44 000。并用NspA融合蛋白检测到患者恢复期血清中存在有抗NspA抗体,且滴度为1∶40时,阳性率为90%。结论成功表达了NspA重组蛋白,并检测到自然感染流脑患者恢复期血清中的NspA抗体。

椰子油美容护肤

说到擦脸美容，我见过使用西瓜皮的，但对妻子的美容方法，我是闻所未闻，可能很多人也一样，那就是使用椰子油。她经常用椰子油擦脸，还认为它们是护肤植物精华中的贵族，蕴含热带植物奇特的生命张力，可以强化毛孔的收缩能力，对肌肤进行最完美的滋NSPA（近似于水疗美容）。

新疆蟠桃中发现油桃茎痘相关病毒和亚洲李属病毒

采用高通量测序(High-throughput sequencing,HTS)技术检测新疆蟠桃感染病毒的情况。采集具有穿孔、脉间褪绿等症状的蟠桃嫩叶,提取总RNA,用于高通量测序,共获得13.36 Gb的数据,包含44563187对reads,其中比对到油桃茎痘相关病毒(nectarine stem pitting-associated virus,NSPa V,KT273409)和亚洲李属病毒(asian prunus virus,APV2,KT893294)基因组的分别有9943对和40036对,经拼接各得到长4978和9393 nt的contig,基因组覆盖率均接近100%(5′端分别差10个和7个碱基),核酸一致度分别为95.0%和92.9%,将此分离物分别命名为NSPa V-Tao和APV2-Tao4。用RT-PCR方法对23个蟠桃树样品进行了检测,结果NSPa V和APV2检出率分别为43.5%和69.6%。通过比较已知NSPa V病毒的核苷酸序列,发现NSPa V-Tao可能是其他分离物重组的结果。