脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因重组乳酸菌表达载体的构建及原核表达

用NcoⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒pMD-18T-NspA及可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的载体质粒pW425et,将NspA基因与pW425et表达载体用T4DNA连接酶相连,构建出重组质粒pW425et-NspA,将其转入至E.coliDH5α感受态细胞中,筛选阳性重组子进行SDS-PAGE和Western-blot检测,经蛋白电泳可见约18 kD的融合蛋白,Western-blot分析表明该蛋白具有与脑膜炎奈瑟氏菌抗体的反应原性。

脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因的克隆及序列分析

为了获得脑膜炎奈瑟氏菌(Nesseria meningitidis,Nm)表面蛋白A(NspA)基因,从脑膜炎患者的血液中分离出脑膜炎奈瑟氏菌并对其进行鉴定,然后根据NspA基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)技术体外扩增得到NspA基因,进行克隆、测序及序列分析。结果显示,其核苷酸序列同源性与Genbank报道的标准菌株相比同源性为100%。克隆获得的基因保持了脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白NspA基因的完整性,保留了其抗原性,为以后进一步开发脑膜炎基因工程疫苗奠定了实验基础。

淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表达和免疫原性鉴定

目的克隆并构建淋病奈瑟菌表面蛋白A(nspA)基因原核表达系统,并对重组产物rNspA进行免疫原性鉴定。方法采用PCR扩增nspA基因,构建nspA基因原核表达系统。SDS-PAGE检测目的重组蛋白rNspA表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rNspA,免疫双扩散试验及Western Blot鉴定rNspA的免疫原性。结果克隆的nspA基因与GenBank中相关序列相似性为100%,rNspA表达量为细菌总蛋白的40.1%,提纯的rNspA在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。rNspA抗血清免疫双扩散效价为1∶4,rNspA抗血清能有效识别rNspA。结论所构建的nspA基因原核表达系统能高效表达rNspA,表达的产物有良好的免疫原性,为淋病奈瑟菌免疫疫苗的研制奠定基础。