肥胖型支气管哮喘患儿血清MMP12、CX3CR1水平与病情严重程度的相关性分析

目的探究血清基质金属蛋白酶12(MMP12)、趋化因子(C-X3-C基元)受体1(CX3CR1)与肥胖型(OB)支气管哮喘患儿病情严重程度的相关性。方法选取2020年9月至2023年5月在本院收治的200例支气管哮喘患儿作为研究对象,根据OB诊断标准将其分为OB组(100例)和非OB组(100例),比较两组血清MMP12、CX3CR1水平。比较不同肺功能分度、不同疾病严重程度患儿血清MMP12、CX3CR1水平。Pearson法分析血清MMP12、CX3CR1水平与肺功能分度、疾病严重程度的关系。结果OB组患儿血清MMP12、CX3CR1水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。不同肺功能分度患儿血清MMP12、CX3CR1水平比较差异具有统计学意义(P<0.05),随着肺功能分度的加重,患儿血清MMP12、CX3CR1水平逐渐上升,差异有统计学意义(P<0.05)。不同疾病严重程度患儿血清MMP12、CX3CR1水平比较差异具有统计学意义(P<0.05),随着患儿疾病严重程度的增加,患儿血清MMP12、CX3CR1水平依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,血清MMP12水平与肺功能分度、疾病严重程度呈正相关(r=0.502、0.517,P<0.05);血清CX3CR1与肺功能分度、疾病严重程度呈正相关(r=0.496、0.511,P<0.05)。结论OB支气管哮喘患儿血清MMP12、CX3CR1水平显著升高,且与患儿病情严重程度和肺功能密切相关。

原发性免疫缺陷病合并卡介苗感染新型白介素12受体β1基因突变一例

目的分析一例白介素12受体β1（IL-12Rβ1）缺陷基因突变合并卡介苗感染患儿的临床特征、基因分析和蛋白表达。方法根据典型的临床表现及免疫学筛查实验排除常见原发性免疫缺陷病（PID），用单克隆抗体流式细胞术检测患者和母亲EB病毒（EBV）永生化的B细胞上IL-12Rβ1蛋白表达，同时，用正向、反向引物分别对患儿和其父、母的IL-12Rβ1基因进行PCR扩增并测序，患儿弟弟产前、产后均已作IL-12Rβ1基因分析。结果患儿有严重、播散性卡介苗接种病，其永生化的B细胞上IL-12Rβ1蛋白表达呈阴性，母亲有部分蛋白表达。患儿为IL-12Rβ1基因纯合单核苷酸替换突变，其第9外显子853位核苷酸（C→T）发生无义突变，使第285位谷氨酸突变为终止密码（Q285X），其父、母亲均为该异常基因的携带者，患儿弟弟产前产后IL-12Rβ1基因正常。结论鉴定出一例新型IL-12Rβ1基因突变（Q285X）患者，发现此基因突变患者的IL-12Rβ1蛋白缺乏，确定此基因突变是引起患者发生播散性卡介苗接种病的根本原因；明确家庭成员携带情况，为产前诊断提供依据。

CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞对肝星状细胞增殖及功能的影响

目的了解CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞在体外对肝星状细胞（HSC）增殖以及功能的影响，初步探讨调节性T淋巴细胞促肝纤维化的机制。方法传代培养HSC LX-2，将免疫磁珠细胞分选（MASC）法分离所得慢性乙型肝炎患者调节性T淋巴细胞与HSC LX-2按不同方式共培养5d，以单独培养的HSC作为对照，细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测共培养HSC增殖情况，ELISA法检测上清液中转化生长因子（TGF）β1含量，放射免疫法检测HSC分泌HA、PCⅢ水平。统计学处理采用LSD-t检验。结果5例调节性T淋巴细胞与HSC比例为1．5：1时HSC增殖最为明显，10例直接接触共培养与使用Transwell系统共培养调节性T淋巴细胞与HSC吸光度值分别为（0．713±0．032）、（0．735±0．028）cpm，均较对照组的（0．677±0．029）cpm增殖明显（t=5．4003，8．7878；均P〈0．01）。10例直接接触共培养与Transwell组细胞上清液中TGFCβ1浓度分别为（781．59±76．45）、（813．53±60．62）pg／mL，显著高于对照组的（722．51±59．66）pg／mL（t=4．0014，6．1653；均P〈0．01）；HA浓度分别为（433．57±27．90）、（445．40±23．73）ng／mL，显著高于对照组的（415．83±19．44）ng／mL（t=3．3124，5．5231；均P〈0．01）；PCⅢ浓度分别为（21．93±1．71）、（23．12±1．87）ng／mL，显著高于对照组的（20．10±1．49）ng／mL（t=4．8082，7．9436；均P〈0．01）。且Transwell组各项结果均显著高于直接接触组（t=3．3875，2．1639，2．2107，3．1354；均P〈0．05）。结论CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞可促进共培养的HSC增殖及其HA、pCⅢ的分泌。体外实验证明，CD4^＋CD25^＋CD127^dim/-调节性T淋巴细胞具有促进肝纤维化的重要作用。

基于CRISPR/Cas9系统Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因敲除的Caco-2细胞系的构建

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1)基因,构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况;通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和干扰素刺激基因20(interferon-stimulatd gene 20,ISG20)mRNA水平。结果质粒LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA测序结果显示插入位置均位于BsmBⅠ酶切黏性末端。共获得2株IFNAR1基因敲除单克隆细胞株,测序结果显示Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第6个外显子发生5 bp缺失,Caco-2-IFNAR1-KO2的第7个外显子发生18 bp缺失,同时有1 bp增加。与野生型Caco-2细胞相比,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。相比于0 ng/mL IFNβ,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为0.566和1.268,P>0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为1.522和1.733,P>0.05)均无明显升高;与野生型Caco-2细胞相比,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为6.763和6.777,P<0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为5.664和5.653,P<0.05)均显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1基因敲除的Caco-2细胞株,该细胞系依赖Ⅰ型IFN受体(interferon alpha/beta receptor,IFNAR)激活的下游分子被明显抑制,为进一步探讨病毒感染Caco-2细胞后的天然免疫反应及复制包装机制提供了有力的工具。

重症肌无力患者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞与抗乙酰胆碱受体抗体和转化生长因子β1含量的相关性

目的探讨重症肌无力（MG）患者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T（Treg）细胞数量与血清抗乙酰胆碱受体抗体（AChR—Ab）和转化生长因子（TGF）-β1含量的相关性。方法前瞻性地纳入40例新近发病或加重的MG住院患者和38名年龄、性别匹配的健康对照，应用流式细胞仪检测外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞数量，酶联免疫法检测血清TGF-β1含量，放免法检测血清AChR-Ab滴度，并对三者进行了相关性分析。结果MG患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞百分率（3．0％±2．5％）显著低于健康对照（4．6％±3．7％，P=0．03）。发病晚、病程长、抗AChR-Ab阳性、胸腺正常或退化以及未接受胸腺切除治疗等因素与MG患者CD4^＋CD25^＋Treg细胞减低有关。在31例非胸腺瘤MG（non-MGT）患者中，血清TGF-β1含量（112ng／L±83ng／L）显著低于健康对照（215ng／L±134ng／L，P=0．00），但在MG各临床亚型之间差异无统计学意义。虽然MG患者CD4^＋CD25^＋Treg细胞百分率与血清AChR—Ab滴度不呈线性相关，但在非MGT患者中二者呈负相关（r=-0．37，P=0．02）。非MGT患者血清AChR—Ab滴度还与Osserman临床分型和MGFA评分之间呈正相关（均r=0．34，P=0．03）。非MGT患者血清TGF-β1含量与美国MG协会（MGFA）评分和CD4^＋CD25^＋Treg细胞百分率无相关性。结论MG患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞百分率和血清TGF-β1含量均明显低于健康对照，可能参与了MG的发病。非MGT患者中Treg细胞百分率与AChR—Ah滴度呈负相关，检测其水平可能对评估MG病情及治疗提供理论依据，但是应用于临床还需要更多的相关研究。

微创钻孔密闭引流术对慢性硬膜下血肿患者HIF-1α、Claudin-5、TGF-β及Smad2/3表达的影响

目的 探讨单孔与双孔钻孔密闭引流术对慢性硬膜下血肿患者血肿外膜中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、紧密连接蛋白5 (Claudin-5)、转化生长因子-β(TGF-β)及细胞信号转导因子(Smad2/3)表达的影响。方法 选取100例慢性硬膜下血肿患者,按随机数字表法分为单孔钻孔引流组和双孔钻孔引流组。分别统计两组患者手术前后血肿外膜中HIF-1α、Claudin-5、TGF-β及Smad2/3的表达量。结果 与术前比较,两组患者术后血肿外膜中HIF-1α、TGF-β、Smad2/3蛋白表达量均下调,且双孔组下调更明显(P <0. 05)。两组患者术后血肿外膜中Claudin-5蛋白表达量均升高(P <0. 05),且双孔组升高更明显,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 单、双孔钻孔密闭引流术是治疗慢性硬膜下血肿行之有效的方法,可使患者血肿外膜中HIF-1α、TGF-β及Smad2/3蛋白表达量下调,Claudin-5的表达量明显升高,且双孔钻孔密闭引流术效果更显著。

S1P/S1PR1通路调节LAMB3的表达对食管鳞癌细胞迁移、黏附和转移的影响

该文主要探讨1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)/1型1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1PR1)通路调节层黏连蛋白亚基β3(laminin subunit beta 3,LAMB3)的表达对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞增殖、迁移、黏附及转移的影响。使用GEO数据库分析LAMB3在ESCC癌组织与癌旁正常组织中的表达差异情况;用Western blot检测人食管上皮细胞HEEC及人食管鳞癌Eca109、TE-1、KYSE-150细胞中LAMB3的表达量;用S1P处理TE-1细胞,或在Eca109细胞中敲低或过表达S1PR1,采用Western blot检测LAMB3的表达情况;S1PR1-EGFP过表达载体和LAMB3小干扰RNA(siRNA)共转染Eca109细胞,采用划痕实验检测迁移能力;采用LAMB3 siRNA或LAMB3短发夹RNA(shRNA)下调ESCC细胞LAMB3的表达,过表达LAMB3的慢病毒上调ESCC细胞LAMB3的表达,通过CCK8法、划痕实验、细胞–基质黏附实验分别检测ESCC细胞的增殖、迁移和黏附能力,Western blot检测上皮–间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表达情况;裸鼠尾静脉注射LAMB3 shRNA敲低的Eca109细胞,观察其转移能力及生存期。结果显示,LAMB3在ESCC癌组织及ESCC细胞中的表达均高于癌旁正常组织及正常食管上皮细胞;S1P作用后的TE-1细胞LAMB3表达水平增高;在Eca109细胞中敲低S1PR1,LAMB3表达下调;在Eca109细胞中过表达S1PR1,LAMB3表达上调,促进细胞迁移,并且干扰LAMB3表达可抑制上述作用;敲低LAMB3的表达,Eca109、TE-1细胞增殖无显著变化,而迁移、黏附受到明显抑制,过表达LAMB3后,Eca109细胞增殖无显著变化,而迁移、黏附增强;LAMB3 shRNA敲低的Eca109细胞EMT过程被抑制,MMP9表达降低,过表达LAMB3则出现相反的效应;与NC shRNA组相比,注射LAMB3 shRNA敲低的Eca109细胞的裸鼠生存期明显延长,肿瘤体内转移灶减少。该研究得出,LAMB3在ESCC细胞及组织中表达上调,S1P/S1PR1通路能诱导LAMB3的表达,促进ESCC细胞的体外迁移、黏附和体内转移。

Wnt／LRP5／β-catenin信号通骨质疏松发病中的作用路在绝经后

目的探讨Wnt／LRP5／β-catenin信号通路在绝经后骨质疏松发病中的作用。方法选取50只6月龄雌性Wistar大鼠，随机分为对照组（n=24）和去卵巢组（n=26），去卵巢组大鼠行双侧卵巢切除术，对照组打开大鼠腹腔后不作任何处理即缝合。去卵巢后0、4和8周分别测定两组大鼠血雌二醇水平和骨密度，4和8周用逆转录-PCR技术检测骨组织中低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）、β连环蛋白（p-catenin）及骨形成关键基因——runt相关基因2（Runx2）mRNA的表达。结果去卵巢组大鼠术后4和8周，出现雌二醇水平明显下降，术后4周时为（92±15）pmol／L，对照组为（117±29）pmol／L；术后8周时为（95±22）pmol／L，对照组为（114±15）pmol／L；两组分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。术后4周时去卵巢组骨密度为（0．076±0．016）g／cm^2，对照组为（0．098±0．016）g／cm^2；术后8周时去卵巢组为（0．052±0．013）g／cm^2，对照组为（0．095±0．028）g／cm^2；两组分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。去卵巢组大鼠术后4周骨组织中LRP5、β-catenin和Runx2mRNA表达水平明显减少，分别为0．97±0．04、0．58±0．05、0．86±0．03，对照组为1．02±0．06、1．04±0．05、1．07±0．21，两组各指标分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论Wnt／LRP5／β-catenin信号通路抑制可能是绝经后骨质疏松重要发病机制之一。