NUAK1能促进乳腺癌上皮-间质转化的发生引起侵袭转移

目的探讨NUAK1(NUAK family SNF1-like kinase 1)与上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)及乳腺癌侵袭转移之间的关系。方法应用免疫组织化学染色法检测100例乳腺癌组织及其癌旁正常组织(>5 cm)中NUAK1、EMT相关蛋白上皮-钙黏素(epithelial-cadherin,E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达,并分析其相关性。应用RNAi技术将合成的小RNA干扰质粒瞬时转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231后,进行Western blot检测转染成功后,应用Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭能力,再检测转染细胞中E-cadherin、Vimentin蛋白的表达情况。结果浸润性导管癌组织中NUAK1蛋白的表达率明显高于导管内癌和癌旁正常组织(P<0.01);浸润性导管癌中NUAK1蛋白的表达与分化程度、淋巴结转移、远处转移、E-cadherin、Vimentin的表达有关(P<0.05),与患者的年龄、肿瘤的大小、ER、PR及c-erbB-2的表达无关(P>0.05)。转染72 h后,与Scr/MDA-MB-231细胞相比,siNUAK1/MDA-MB-231细胞中NUAK1蛋白表达水平明显降低的同时,细胞的体外侵袭能力明显降低(P<0.05)。并且伴有Vimentin蛋白表达水平的降低和E-cadherin蛋白表达水平的升高(P<0.05)。结论 NUAK1能促进乳腺癌EMT的发生,从而促进乳腺癌的侵袭转移。

NUAK1通过影响F-actin聚合促进乳腺癌的侵袭转移

本课题组先前研究证明NUAK1/ARK5参与乳腺癌、胶质瘤侵袭转移,但机制尚不清楚.本文证明,NUAK1通过影响F-actin聚合促进乳腺癌的侵袭转移.应用小RNA干扰技术敲除乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的NUAK1,用G418进行稳定筛选,并用Western印迹进行蛋白质表达检测,结果显示,成功敲除MDA-MB-231细胞中的NUAK1;采用Transwell侵袭实验检测NUAK1在乳腺癌细胞侵袭转移中的作用,结果表明,NUAK1被干扰的SiNUAK1/MDA-231细胞的侵袭能力明显减弱;应用免疫荧光法对细胞的F-actin进行荧光染色,半定量F-actin聚合分析结果显示,IGF-1在转染空载的细胞组(Scr/MDA-231)能诱导肌动蛋白短暂的聚合反应,而在敲除NUAK1的细胞组(SiNUAK1/MDA-231)肌动蛋白的聚合显著减少;用细胞因子IGF-1刺激乳腺癌细胞观察cofilin磷酸化,结果显示,在敲除NUAK1的细胞组(SiNUAK1/MDA-231),IGF-1诱导的cofilin的磷酸化明显受抑制.上述结果表明,NUAK1能通过促进F-actin的聚合从而影响乳腺癌细胞的侵袭转移.

HeLa细胞中激酶NUAK1调控Tuberiun的磷酸化

NUAK1是LKB1的下游激酶之一,可被LKB1磷酸化而激活,但对其在LKB1相关信号通路中的功能仍缺乏了解.本研究发现在HeLa细胞中重建LKB1表达后NUAK1与tu-berin蛋白免疫共沉淀,提示在野生型LKB1存在时NUAK1与tuberin可能存在直接相互作用.进一步的激酶活性测定和in vivo蛋白磷酸化实验表明:在HeLa细胞中葡萄糖匮乏条件下,野生型LKB1可显著激活NUAK1的激酶活性;而被激活的NUAK1可明显提高tuberin的磷酸化水平,使用NUAK1siRNA pool干扰NUAK1的表达则几乎将tuberin的磷酸化水平降低为零.上述结果表明NUAK1可能介导了LKB1对tuberin磷酸化的调节,进而下调mTOR通路,抑制蛋白质合成与细胞生长增殖.

NUAK1在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌CNE2、HK1细胞迁移和侵袭能力的影响

目的检测NUAK1在鼻咽癌及鼻咽黏膜慢性炎组织中的表达,进一步探讨沉默NUAK1对鼻咽癌CNE2、HK1细胞迁移和侵袭能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR技术检测16例鼻咽癌和16例鼻咽黏膜慢性炎组织中NUAK1 mRNA的表达,免疫组织化学方法检测88例鼻咽癌及30例鼻咽黏膜慢性炎组织标本中NUAK1蛋白的表达,并分析NUAK1蛋白的表达与临床病理参数的相关性。应用siRNA技术转染CNE2、HK1细胞,随后进行Transwell迁移实验和侵袭实验,观察沉默NUAK1组相对空载组鼻咽癌细胞体外迁移和侵袭能力的改变。结果NUAK1 mRNA和蛋白在鼻咽癌中的表达均高于鼻咽黏膜慢性炎组织(P<0.05),且鼻咽癌中NUAK1蛋白的表达与淋巴结转移相关(P<0.05)。转染siRNA后,Transwell迁移实验和侵袭实验结果显示,实验组细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于空载组(P<0.05)。结论NUAK1在鼻咽癌组织中高表达,在鼻咽癌CNE2、HK1细胞沉默NUAK1表达可抑制其迁移和侵袭,提示NUAK1的表达可能与鼻咽癌的侵袭转移有关。

蛋白激酶NUAK1的定位及其与NF-κB信号通路关系的探讨

目的:确定蛋白激酶NUAK1的定位,检测其是否参与NF-κB信号通路。方法:构建质粒NUAK1-pEGFP顺转于293细胞,然后用DAPY染核,荧光显微镜下观察NUAK1的定位。构建质粒NUAK1-pcDNA3.1和显性失活突变体NU-AK1(D178N)-pcDNA3.1,以空载pcDNA3.1做对照,分别过表达于带稳转有NF-κB荧光酶素报告基因质粒的293细胞株中,检测在有或没有TNF-α刺激下的NF-κB荧光酶素报告基因的活性,为进一步确认,对NUAK1-pcDNA3.1设了个浓度梯度进行检测。结果:293细胞中,NUAK1定位于细胞核。在TNF-α的刺激下,以空载和显性失活突变体为对照,NU-AK1显著抑制NF-κB的活性,且与其表达量成正相关。结论:由于NUAK1定位于细胞核中,且显著抑制TNFα刺激下NF-κB的活性,所以NUAK1可能参与NF-κB的转录调控。

稳定表达siRNA-NUAK1基因95D细胞系的建立

目的建立稳定表达siRNA-NUAK1基因的人肺巨细胞高转移株95D细胞系,为研究NUAK1在肺癌细胞转移侵袭中的作用机制提供基础。方法利用脂质体把pGCsilencerU6/GFP/Neo-RNAi-NUAK1重组质粒转染95D肺癌细胞,G418筛选稳定转染细胞系,从中挑出单克隆,分别通过荧光显微镜和RT-PCR法鉴定单克隆细胞和NUAK1基因的转染、抑制效果。结果从稳定转染细胞中,成功挑出单细胞克隆3株,其中2株细胞的NUAK1基因的表达被显著抑制。结论利用siRNA技术成功建立了稳定表达siRNA-NUAK1基因的95D细胞系,为研究NUAK1因子与肺癌转移侵袭的关系及机制提供了细胞模型。

miR-30a-5p和NUAK1在非小细胞肺癌中的表达及对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的研究miR-30a-5p和靶基因NUAK1在非小细胞肺癌中的表达及对A549细胞增殖、迁移侵袭的影响。方法收集2016-09至2019-03在保定市第一医院行手术切除治疗的非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁组织标本64例,QPCR和Western blot分别检测非小细胞肺癌组织样本和细胞中miR-30a-5p和NUAK1的表达;TargetScan网站预测miR-30a-5p与NUAK1间的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验和Western blot进行验证;MTT和Transwell实验检测miR-30a-5p及联合过表达NUAK1对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果非小细胞肺癌组织中miR-30a-5p的相对表达量(0.33±0.14)低于癌旁组织(1.00±0.21),差异有统计学意义(t=21.237,P<0.05);非小细胞肺癌组织中NUAK1 mRNA表达(4.13±1.87)和蛋白表达(3.41±1.62)均高于癌旁组织(1.00±0.17、1.00±0.16),差异有统计学意义(t=13.335、11.844,P<0.05)。非小细胞肺癌细胞系H460、H1299、A549中miR-30a-5p表达量(0.35±0.03、0.51±0.05、0.28±0.03)低于人正常肺上皮细胞BEAS-2B(1.00±0.11),差异有统计学意义(F=77.100,P<0.05);H460、H1299、A549细胞中NUAK1 mRNA相对表达量(2.98±0.30、2.39±0.24、3.42±0.36)和蛋白相对表达量(3.06±0.31、2.27±0.23、4.12±0.41)均显著高于BEAS-2B细胞(1.00±0.09、1.00±0.11),差异有统计学意义(F=46.660、63.070,P<0.05)。结论miR-30a-5p可通过靶向NUAK1抑制非小细胞肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭,提示miR-30a-5p和NUAK1可能成为一种新的临床诊断和治疗非小细胞肺癌的靶点。

非特殊型浸润性乳腺癌组织NUAK1、NUAK2蛋白表达与临床病理特征和预后的关系研究

目的:探讨非特殊型浸润性乳腺癌(IBC-NST)组织NUAK家族SNF1样激酶1(NUAK1)、NUAK家族SNF1样激酶2(NUAK2)蛋白表达与临床病理特征和预后的关系。方法:选择2018年6月至2020年6月徐州医科大学附属医院收治的132例IBC-NST患者。检测癌组织以及癌旁组织中NUAK2、NUAK1蛋白表达情况,分析癌组织中NUAK2、NUAK1蛋白表达与临床病理特征的关系。IBC-NST患者出院后随访3年,采用Kaplan-Meier生存曲线分析NUAK1、NUAK2阴性和阳性表达患者生存差异,采用多因素COX回归分析IBC-NST患者预后的影响因素。结果:与癌旁组织相比,IBC-NST癌组织NUAK2、NUAK1蛋白阳性表达率更高(P<0.05)。IBC-NST癌组织NUAK2、NUAK1蛋白阳性表达率与分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况有关(P<0.05)。NUAK1阳性表达IBC-NST患者3年无进展生存(PFS)率低于NUAK1阴性表达的IBC-NST患者(P<0.05),NUAK2阳性表达IBC-NST患者3年PFS率低于NUAK2阴性表达的IBC-NST患者(P<0.05)。IBC-NST患者预后不良的危险因素包括NUAK1阳性表达、淋巴结转移、NUAK2阳性表达(P<0.05)。结论:IBC-NST癌组织NUAK1、NUAK2蛋白阳性表达率显著增高,NUAK1、NUAK2蛋白阳性表达与分化程度、淋巴结转移、TNM分期、不良预后有关。