常见食源性病原菌的快速检测技术研究进展

食源性病原菌广泛存在于自然环境中,可通过肉类、海产品、奶制品等多种媒介传播,引起食源性疾病的发生。目前检测食源性病原菌的方法主要以平板培养辅以生化鉴定和血清型鉴定为主,检测的周期较长,效率较低,因此建立快速、精准的食源性病原菌检测方法对常见病原菌的现场检测及疾病的快速诊断尤为重要。本文对近年来常见食源性病原菌的快速检测方法进行了概述,主要包括免疫学检测手段、分子生物学检测方法和生物传感器检测技术,比较其优缺点,着重介绍了可以实现现场检测与实时检测的新兴技术:核酸-微流控检测技术,以期为常见食源性病原菌的预防与检测提供相关理论参考。

CRISPR-Cas系统在病原核酸检测中的研究进展

CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统,由簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成,因其识别和切割特定DNA或RNA序列,而成为分子诊断领域研究的热点。研究人员利用Cas蛋白(Cas12、Cas13、Cas14、Cas3等)结合信号放大和转化技术(荧光法、电位法、比色法、侧向流动技术等),开发了许多高灵敏度、高特异性、低成本的诊断平台,为病原核酸检测提供了新途径。本文介绍了CRISPR-Cas系统的生物学机制及分类,总结现有的基于Cas蛋白反式切割活性开发的病原核酸检测技术,描述其特点、功能和应用场景,并对该系统的未来应用前景进行展望,期望CRISPR-Cas系统成为包括核酸检测在内的多靶标的理想检测平台。

适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流层析试纸条技术(lateralflow dipstick, LFD)结合的RPA-LFD技术检测。实验优选20~100 mmol/L Tris-HCl、50~250 mmol/L KCl、0.01%~0.10%十二烷基硫酸锂(LDS)、0.5%~2.0%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EGTA2Na)、0.5~5.0 mmol/L牛血清白蛋白(BSA)、1~5 mg/mL明胶、0.01%~0.10%海藻糖、1%~5%甜菜碱等配制成核酸释放剂。以对虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性样本和阴性样本对核酸释放剂各组分间配比进行优化,采集绿豆大小的对虾肝胰腺组织加入100μL核酸释放剂,100℃加热3 min,取上清液进行RPA-LFD反应,测试各组分不同浓度配比;并以对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)阳性样品及阴性样品作为检测模板对优化后核酸释放剂再次验证。结果显示,核酸释放剂的各组分最佳配比为100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、0.02%LDS、0.5%Triton X-100、1 mmol/L EGTA2Na、0.05%海藻糖、1 mg/mL明胶、0.5 mmol/L BSA、2%甜菜碱。RPA-LFD方法检测可显著区分阳性和阴性样品。本研究优化的核酸释放剂,适用于RPA-LFD检测对虾肝胰腺病原DNA样品的制备,有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤,极大地提高了核酸水平病原检测效率。

基于核酸扩增-侧流层析试纸的食源性致病菌快速检测研究进展

食源性致病菌严重危害食品安全。传统的致病菌检测方法费时耗力,难以应对现代食品安全检测快速、简便的需求。分子生物学检测方法,如聚合酶链式反应法、等温核酸扩增法以及基于规律成簇间隔短回文重复序列的核酸检测技术等,已被广泛应用于食源性致病菌检测,为保障食品安全发挥了重要作用。近年来,联用核酸扩增检测技术和免疫层析技术成为食源性致病菌快速检测的研究热点。本文总结了核酸扩增和侧流层析试纸联用快速检测食源性致病菌的研究进展,重点讨论了其优缺点,并展望其未来发展方向,以期为食源性致病菌的检测和防控提供参考。

CRISPR-Cas系统在病原微生物分子诊断中的研究进展

快速、灵敏、准确的病原微生物检测方法对感染性疾病的诊治及防控至关重要。基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统的检测技术在病原微生物核酸检测中具有高灵敏度和高特异度的特点,该文概述了CRISPR-Cas系统的作用机制及不同Cas的核酸酶活性,总结了基于CISPR-Cas系统的检测技术在病原微生物核酸检测中的研究现状,对该系统在核酸检测应用中的挑战进行了综合分析,并提出了目前存在的一些解决方案。目前基于CRISPR-Cas系统的非核酸分析物检测仍处于前期研究阶段,但其在扩大检测范围、缩短检测时间、提高检测灵敏度等方面具有较大潜力,为开发基于CRISPR-Cas系统的病原微生物检测平台提供新思路。

奶牛乳房炎病原微生物20联核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的临床应用评估

为了评估商品化的奶牛乳房炎病原微生物20联核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(后文简称为“检测试剂盒”)在临床应用中的适用性,本试验采用传统细菌分离培养、检测试剂盒、16S rRNA基因扩增子测序和药物敏感性试验对宁夏回族自治区9个牧场155份奶牛乳房炎奶样分别进行菌株鉴定和耐药性检测,并将检测试剂盒与其他3种检测结果进行比较和分析。结果显示,检测试剂盒与传统细菌分离培养在病原菌检出情况上基本保持一致,均主要检出了大肠杆菌、芽孢杆菌属和凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)等;检测试剂盒与16S rRNA基因扩增子测序结果在菌属组成上一致性较高,均主要检出了假单胞菌属、链球菌属和葡萄球菌属等;药物敏感性试验结果显示,检出率较高的66株病原菌分离株对β-内酰胺类抗菌药物的耐药率普遍偏高;奶样中β-内酰胺酶耐药基因blaZ的检测试剂盒检出结果与同一奶样中分离菌株的药物敏感性试验结果一致率达58%(7/12)。综上所述,该检测试剂盒具有较高的准确度和病原覆盖率,可为牧场奶牛乳房炎主要病原的快速诊断和耐药基因(blaZ)监测提供有效的技术支持,从而降低抗菌药物的使用量,以减少牧场经济损失。

荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的对比研究

目的对比荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的应用价值。方法随机在2020年1月~2023年1月天津市河东区疾病预防控制中心接收的呼吸道感染的患者中选取120例作为研究对象,分别采用荧光定量核酸扩增(PCR)检测技术与环介导等温扩增技术(LAMP)检测呼吸道病原体,并对检测结果进行比较分析。结果120例患者中使用LAMP检出细菌感染85例(阳性率为70.83%)。荧光定量PCR检出细菌感染72例(阳性率60.00%),差异无统计学意义(P>0.05);其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法,差异有统计学意义(P<0.05);采用荧光定量PCR与LAMP法对呼吸道感染10种病原体进行检测,结果表明,除LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌的检测一致性极好,荧光定量PCR对耐甲氧西林葡萄球菌的检测一致性极好(Kappa≥0.75),其余病原体采用荧光定量PCR与LAMP法检测一致性均中等(0.4≤Kappa<0.75)。结论荧光定量PCR与LAMP两种检测方法对呼吸道感染病原体检出率均较高,其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法。

基于CRISPR/Cas13a系统的发热伴血小板减少综合征病毒快速检测方法的建立

目的建立基于CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)系统的快速、灵敏的现场发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核酸检测方法。方法首先,经序列比对分析得到SFTSV S基因特异性保守区,设计并筛选多酶恒温扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)引物和靶标CRISPR RNA(CRISPR RNA,crRNA),经荧光信号和免疫层析试纸读取检测结果。为提升检测敏感度在单反应体系中加入多个检测靶标crRNA。并利用蜱感染模拟样本和蜱源样本验证该方法对蜱样本现场核酸检测的有效性。结果MIRA-CRISPR/Cas13a荧光法检测SFTSV的最低检测限为1 copy/μL,试纸法的最低检测限为10 copies/μL。特异性实验表明SFTSV与其他4种阴性对照病原均无交叉反应。该方法检测蜱感染模拟样本的灵敏度优于RT-PCR法。应用所建立的方法检测29份蜱源SFTSV样本,共检出20份阳性样本和9份阴性样本,与RT-PCR检测结果符合率为100%。结论本文所建立的方法可用于SFTSV的现场快速检测。

反式切割CRISPR/Cas技术在食源致病微生物检测方面的原理及应用

食源性致病微生物是食品安全的一大严重威胁,传统的生化检测手段面临着一系列挑战。近年来,随着成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术的逐步发展,具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系受到了越来越多的关注。本文综述了具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系的起源与分类,并详细介绍了具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系的作用原理。同时,本文对反式切割CRISPR/Cas技术在食源性致病微生物领域的多方面应用进行了综述,并讨论了该技术的优劣和未来发展方向。

呼吸道病毒快速检测的临床应用现状与挑战

急性呼吸道感染给全球卫生系统造成了巨大负担,其中病毒是常见的病原体。快速和准确的病原学诊断对呼吸道病毒感染后及时抗病毒治疗、减少抗生素滥用和疾病防控具有重要意义。快速抗原检测和快速核酸检测是目前临床常用的呼吸道病毒快速检测手段。尽管呼吸道病毒快速检测能满足特定的临床需求,但其在临床应用中仍存在挑战。本文主要围绕呼吸道病毒快速检测的发展、临床应用价值以及面临的挑战等方面进行综述,以期为临床提供参考。

罗定地区呼吸道病原体核酸检测在小儿呼吸道疾病诊断中的价值

目的探讨广东罗定地区近年小儿呼吸道急性感染病原体的流行特征,为小儿呼吸道感染的防治和抗生素的合理应用提供指导数据。方法选取2021年7月至2023年6月在罗定市人民医院儿科住院诊治的急性呼吸道感染患儿1603例,采集小儿咽/鼻咽拭子标本,采用多重扩增核酸检测法对样本进行15种常见呼吸道病原体检测,分析各种病原体在小儿不同年龄段、不同季节的分布情况。结果所检病原体总阳性率为74.6%(1196/1603),单一感染率为35.4%,混合感染率为39.2%。不同年龄段:阳性检出率由高到低依次为幼儿组(30.3%)、婴儿组(21.8%)、学龄前儿童组(17.6%)、小学儿童组(5.0%),各组间阳性率互相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同季节:阳性检出率夏春季最高(分别占25.3%和20.5%),各季节感染情况不同,各季节阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05);不同季节流行的病原体不同,春季以卡他莫拉菌(MC)、鼻病毒(HRV)、流感嗜血杆菌(Hi)流行为主;夏季以呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)流行为主;秋季以RSV、MC流行为主;MC、流感病毒B型(INF-B)在冬季最流行。结论小儿呼吸道感染在本地区全年呈散发流行,以MC、CMV和RSV感染最为常见,夏春季是高发季。值得临床诊疗重视的是低年龄更容易发病,且混合感染在低年龄组中占比较高。通过核酸联检的方式,可以快速、准确地明确患儿的病原体,为临床诊治提供参考。

食品安全快速检测技术在食源性致病菌检测中的应用

本文针对食源性致病菌检测的迫切需求,深入分析了主要致病菌的特性,并探讨了食品安全快速检测技术的多种方法及其面临的挑战。文章重点介绍了核酸扩增、免疫分析、生物传感等技术的优势与局限,同时针对样品基质复杂性、低丰度致病菌的富集分离以及现场快速检测设备的稳定性问题,提出了具体的技术改进对策。通过优化检测技术,可显著提升食源性致病菌检测的灵敏度、特异性和操作便捷性,为食品安全监管提供强有力的技术支撑。

基于支气管肺泡灌洗液细菌核酸检测的桂林地区迁延性细菌性支气管炎病原研究

目的:通过支气管肺泡灌洗液(BALF)细菌核酸检测,研究桂林地区迁延性细菌性支气管炎(PBB)患儿的病原体。方法:选取2021年7月—2023年2月桂林医学院第二附属医院儿科收治的行支气管镜检查的PBB患儿40例作为研究对象,通过支气管镜取BALF进行核酸检测,查找病原体。结果:BALF细菌核酸检测结果显示,40例PBB患儿中有38例检出病原体,病原体共检测出61株。其中,以肺炎链球菌占比最高(44.2%),流感嗜血杆菌(22.9%)次之。1~3岁年龄段病原体检出率最高,4~6岁检出率次之。结论:桂林地区PBB常见的病原体为肺炎链球菌,与社区获得性肺炎相符,可为本地区提供参考。

社区获得性肺炎多种病原菌核酸检测及CRP在预后评估中的应用价值

目的:探讨社区获得性肺炎(CAP)多种病原菌核酸检测及C反应蛋白(CRP)在预后评估中的应用价值。方法:回顾性选取2023年1月-2024年5月我院收治的98例CAP患者临床资料,收集其痰液样本进行痰细菌学检查和多种病原菌核酸检测,分析不同检测方法病原菌检出情况及诊断所需时间,采集患者治疗第1、3、7 d的空腹静脉血测定CRP水平,比较不同预后患者一般资料、血清CRP水平,并探讨CRP在预后评估中的应用价值。结果:98例CAP患者,经痰细菌学检出病原菌阳性62例(63.27%),多种核酸检测检出病原菌阳性69例(70.41%),两种检测方法的阳性检出率差异无统计学意义(χ2=1.128,P=0.288);以痰细菌学检查结果为标准,多种病原菌核酸检测的敏感度、特异度、准确率分别是91.94%(57/62)、66.67%(24/36)、82.65%(81/98),且Kappa值=0.611,一致性较好。多种核酸检测诊断所需时间明显短于痰细菌学检查(P<0.05)。将纳入患者依据临床转归情况分为存活组(好转出院,n=79)和死亡组(死亡,n=19),两组性别、年龄、病程及合并症比较均无统计学差异(P>0.05)。治疗第1、3、7 d,两组血清CRP水平均呈明显降低趋势(P<0.05),但存活组CRP水平均明显低于同期死亡组(P<0.05)。ROC曲线显示,CRP评估CAP患者预后的ROC曲线下面积为0.840(95%CI:0.741-0.939,P<0.05),敏感度、特异度为63.16%、94.94%,最佳截断值为52.99 mg·L^(-1)。结论:CAP中应用多种病原菌核酸检测与传统的细菌检出方法有较高一致性,诊断所需时间更短,且动态监测CRP水平对评估患者预后具有重要价值,利于保证治疗效果。

社区获得性肺炎患儿肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测情况及特点分析

目的:探讨社区获得性肺炎(CAP)患儿肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测病原体分布情况,并进一步分析病原体分布特点。方法:选取240例行纤维支气管镜肺泡灌洗的CAP患儿作为研究对象,所有患儿均进行痰细菌培养、肺泡灌洗液细菌培养及肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测。比较上述三种检测方法结果的阳性率,并按照年龄将患儿分为<2岁、2~5岁、>5岁年龄组,分析肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测病原体在各组的分布特征。结果:240例患儿中,痰细菌培养结果阳性44例,阳性率18.34%;肺泡灌洗液细菌培养结果阳性者19例,阳性率7.93%;肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测结果阳性140例,阳性率58.33%。肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测的阳性率高于肺泡灌洗液细菌培养及痰细菌培养(P<0.05)。<2岁、2~5岁,>5岁年龄组患儿的病原体感染率分别为44.00%、61.27%及64.58%。140例肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测阳性患儿共检测病原体162株,排名前三的是肺炎链球菌、肺炎支原体及流感嗜血杆菌;其中,肺炎链球菌、肺炎支原体及流感嗜血杆菌占比均以2~5岁年龄组感染率最高。结论:肺泡灌洗液呼吸道病原体核酸十三项检测对CAP患儿诊疗具有重要价值,尤其是可准确检测肺部常见细菌、肺炎支原体感染情况。

成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)

呼吸道感染性疾病在临床中极为常见,病原体的快速检测和精准诊断是其有效治疗的前提。传统微生物学及免疫学技术对呼吸道病原体检测的灵敏度偏低,核酸检测技术的发展和临床应用大幅提高了呼吸道病原体的诊断能力。如何基于患者基础疾病、呼吸道感染类型及病原谱合理选择核酸检测技术并正确理解其临床应用价值,成为重要的临床问题。为此,中华检验医学培训工程专家委员会联合中华医学会呼吸病学分会组织我国多学科专家共同撰写了《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)》。该共识参考国内外指南及文献,分析了实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术、等温扩增技术、数字PCR技术、核酸即时检测技术和病原体高通量测序技术的临床应用场景、技术特点和性能验证要求,以及该类技术在成人急性上呼吸道感染、气管支气管炎、社区获得性肺炎、医院获得性肺炎/呼吸机相关性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、肺结核和免疫功能受损人群呼吸道感染中的应用,以供临床参考借鉴。

液滴微流控结合核酸扩增技术在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是影响食品安全的重要因素,随着生物技术发展及人们对食品安全要求的提高,食源性致病菌的检测方法也不断更新和升级。微流控技术将样品预处理、分离、检测等过程集成在微小的芯片上完成多种功能,而液滴微流控作为其中一个重要的分支,可利用两液体互不相溶特性形成的分散微液滴进行高通量的测试。本文针对核酸扩增方式的不同,比较总结了液滴微流控-数字化聚合酶链式反应、液滴微流控-数字化环介导等温扩增、液滴微流控-数字化重组酶聚合酶扩增检测方法的特点,介绍了其在食源性致病菌检测中的应用,并对该技术的未来发展前景进行了展望。液滴微流控技术结合数字化核酸扩增,可实现对食源性致病菌的智能化、连续化、精准化和微型化的快速检测,本文为其在食源性致病菌快速检测领域的发展提供了参考资料。

基于CRISPR/Cas系统的病原核酸检测技术研究进展

作为一种古老的细菌和古菌免疫系统,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白[clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein(Cas),CRISPR/Cas]系统现已发展为新兴的热门基因编辑工具,极大地推动了其他多个生物学相关领域的发展。其中,通过结合CRISPR/Cas系统与核酸恒温扩增技术建立了一些新型的高效、灵敏、不依赖仪器设备的检测方法,如DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans-reporter,DETECTR)、特异性高灵敏度的酶报告器系统(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK)等,不但提高了CRISPR/Cas系统在不同应用场景下的检测性能,更进一步激发了其在现场检测中的应用潜力。本文基于近年来被广泛应用的3种CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a以及CRISPR/Cas13)的生物核酸检测方法,阐述了CRISPR/Cas系统的生物学意义及一般作用原理,并通过回顾以往开展的CRISPR/Cas系统相关的病原检测研究,比较分析了不同检测系统的特点以及在实际应用过程中可能存在的不足,为针对不同病原在不同应用场景下建立更加高效、合理的CRISPR/Cas系统检测方法提供了有益参考。

等温核酸扩增技术在食源性致病菌检测中的研究进展

等温扩增技术是近年来发展迅速的一种新型核酸扩增技术,其反应过程始终维持在恒定的温度下,降低了对精密仪器和检测场地的要求,并大幅度缩短了检测时间,更能满足准确、快速、灵敏、便携的日常检测需求。目前,食源性致病菌仍是影响食品安全的主要因素之一,等温核酸扩增技术已成功应用于部分食源性致病菌的检测中,具有广阔的应用前景,有望成为食源性致病菌快速检测的新方法。本文综述了环介导核酸等温扩增、滚环扩增、跨越式滚环扩增、重组酶聚合酶扩增、等温多自配引发扩增、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链置换扩增、交叉引物扩增9种等温核酸扩增技术的扩增原理和优缺点,及其在食源性致病菌检测中的应用研究进展,提出了样品前处理、引物设计、结果判读、检测灵敏度、检测通量方面存在的共性问题,并给出相应解决措施,以期为等温核酸扩增技术在食源性致病菌快速检测中的实际应用和相关标准的制定提供研究思路。

扩增型和非扩增型CRISPR/Cas系统在食源性致病菌快速检测领域应用的研究进展

食源性致病菌引起的食品安全事件频发已对公众健康和社会经济造成巨大的影响,构建针对其快速、高效的检测方法是保障食品安全的重要手段。成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR/Cas是广泛存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统,可以有效地识别并切割外源核酸。因此,可以利用CRISPR/Cas系统这一对外源核酸的识别及切割活性实现对食源性致病菌的快速高效检测。本文详细介绍基于核酸扩增和免核酸扩增的两种CRISPR/Cas系统,综述其在对各种食源性致病菌检测中的应用,讨论它们的优势、局限性以及未来的发展趋势,旨在为建立更高效的食源性致病菌检测方法提供技术参考,以期更有效地减少食源性致病菌造成的食品安全问题。