A brief review of novel nucleic acid test biosensors and their application prospects for salmonids viral diseases detection

Viral diseases represent one of the major threats for salmonids aquaculture.Early detection and identification of viral pathogens is the main prerequisite prior to undertaking effective prevention and control measures.Rapid,sensitive,efficient and portable detection method is highly essential for fish viral diseases detection.Biosensor strategies are highly prevalent and fulfill the expanding demands of on-site detection with fast response,cost-effectiveness,high sensitivity,and selectivity.With the development of material science,the nucleic acid biosensors fabricated by semiconductor have shown great potential in rapid and early detection or screening for diseases at salmonids fisheries.This paper reviews the current detection development of salmonids viral diseases.The present limitations and challenges of salmonids virus diseases surveillance and early detection are presented.Novel nucleic acid semiconductor biosensors are briefly reviewed.The perspective and potential application of biosensors in the on-site detection of salmonids diseases are discussed.

2016至2020年杭州地区无偿献血人群HIV感染状况分析

目的了解杭州地区无偿献血人群HIV感染状况,为本地区降低HIV经输血传播风险,制定有效献血者招募及艾滋病防控策略提供数据支持。方法采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和病原体核酸检测技术(nucleic acid testing,NAT)对2016年1月至2020年12月杭州地区902847例无偿献血者标本进行抗HIV-Ⅰ/Ⅱ抗体/抗原和HIVRNA检测。抗-HIV抗体/抗原或HIVRNA反应性标本送杭州市疾病控制中心进一步采用Western blot法和NAT进行确认。结果2016年1月至2020年12月杭州地区共检测HIV确证阳性103例,阳性检出率为0.01%,其中101例ELISA和NAT筛查均为阳性反应,2例ELISA筛查为阴性反应,NAT为阳性反应。103例感染者中,以男性(91.26%,94/103)、18~35岁(69.90%,72/103)、初次献血者(68.93%,71/103)为主。2016至2020年献血者HIV阳性率呈逐年下降趋势(χ^(2)=7.181,P=0.007)。男女献血者HIV阳性率各年的差异无统计学意义(χ^(2)=10.336,P=0.350;χ^(2)=0.653,P=0.957)。各年龄组献血者HIV阳性率各年的差异无统计学意义(χ^(2)=6.378,P=0.173;χ^(2)=2.318,P=0.678;χ^(2)=5.284,P=0.259;χ^(2)=9.183,P=0.057)。结论近5年HIV感染在杭州市无偿献血人群中呈低流行水平,但仍存在感染风险,应加强在低危人群中招募献血者并且应采用先进的检测技术,选择合适的检测策略,保证血液安全。

追踪隔离措施与核酸检测力度对南京新型冠状病毒肺炎疫情影响的分析与评估

2021年7月,南京市爆发由德尔塔变异毒株引起的新型冠状病毒肺炎疫情(COVID-19)。依据南京市卫生健康委员会公布的实际数据,建立符合疫情发展的时间依赖COVID-19传播动力学模型,将实时数据应用于模型参数估计和有效再生数计算,分析和评估了此次疫情采取的隔离防控措施和核酸检测强度。结论表明:隔离力度和核酸检测强度对疫情防控有重要影响。该研究结果在一定程度上促进了新型冠状病毒肺炎传播动力学建模与分析工作的研究,对未来应对突发性传染病有一定借鉴意义。

2018—2023年新疆乌鲁木齐市主城区鸽新城疫流行情况实验室调查

为了解主城区近年鸽散养户新城疫的免疫情况和养殖环境中的流行情况,2018—2023年分别采集4个主城区25个散养户的鸽血清样本1972份、鸽舍环境棉拭子150份、鸽双腔棉拭子750份,通过血凝及血凝抑制试验和荧光定量PCR的方法,进行新城疫抗体水平监测和新城疫病毒核酸检测。结果表明,乌鲁木齐市4个主城区免疫合格率呈逐年上升的趋势,仅2022年鸽新城疫免疫抗体均低于农业农村部规定的70%,其它均高于该标准;4个主城区中环境棉拭子新城疫病毒核酸群体阳性率2018—2023年分别为28%、20%、16%、28%、36%和20%;鸽双腔棉拭子新城疫病毒核酸个体阳性率2018—2023年分别为12.8%、11.2%、8.8%、8%、9.6%和4%。

石家庄地区2012-2014年献血人群NAT检测情况分析

目的为进一步提高血液安全性,降低输血感染风险,分析在石家庄地区献血者中开展血液传染病毒核酸检测(NAT)的必要性和可行性。方法应用浩源核酸检测系统,对经ALT及两遍HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV、梅毒螺旋体ELISA检测结果均呈非反应性的287 728份标本,进行HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA-3项联合NAT筛查,初筛采用8人份混样法,对检出某项有反应性的混样池进行单人份拆分检测。结果 ELISA检测非反应性的287728份标本,共检测42 472个混样池,检出209个HBV DNA反应性混样池,混样池阳性率为4.92‰;拆分结果为84例HBV DNA阳性,检测阳性率为0.29‰,所有标本中无HCV RNA和HIV-1 RNA的检出。结论核酸检测可缩短血液病毒的检测"窗口期"并有效降低隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)的发生几率,进一步提高血液安全性。

江西省吉安市莱姆病疑似病例调查研究

目的了解江西省吉安市莱姆病疑似病例中确诊病例情况及其临床表现特征和地区来源分布,为莱姆病及时诊治提供依据。方法2021年12月至2022年8月从吉安市中心人民医院收集了133份莱姆病疑似病例血清,采用国际上通用的“两步法”进行莱姆病抗体检测,并采用巢式PCR方法检测血清中莱姆病螺旋体的基因,阳性标本进一步测序分析。结果133份莱姆病疑似病例血清中有25份伯氏疏螺旋体检测阳性,总阳性率为18.80%。其中,20份样本抗体检测阳性,阳性率为15.04%;6份样本核酸检测阳性,阳性率为4.51%。6例核酸检测阳性的患者的5S-23S rRNA基因间隔区的序列均与扬子疏螺旋体(Borrelia yangtzensis)的相应序列一致,并且其中1份样本抗体检测也为阳性。25例阳性患者来自吉安市的9个县区,其中吉州区的患者最多,占44%。阳性患者出现莱姆病相关症状,包括关节病变、神经疾病、感染性发热、皮炎或胸痛,其中关节病变的病人最多,占72%。6例扬子疏螺旋体感染者来自吉州区,其中4例表现为关节病变,2例表现为感染性发热。结论本次研究首次证实江西省吉安市存在莱姆病患者,并首次在我国南方的病人体内检测出扬子疏螺旋体。研究提示该地区医务人员在接诊具有关节炎、神经系统等症状的病例时,应考虑患者可能罹患莱姆病。研究表明吉安市存在莱姆病自然疫源地,应进一步开展莱姆病的调查和监测。

环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用

病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断。基于这种情况,该文主要阐述了LAMP的原理、特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展。LAMP技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性、引物设计复杂等不足之处。该文综述了近年来LAMP技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向。

科研项目成果在通识课程中的教学实践与探索

以“众里寻他千百度——核酸检测的应用”实验项目为例,探索将科研项目的部分内容应用于高校生物类通识课程的实践经验。该项目以拟南芥T-DNA插入突变体为材料,通过基因组DNA的提取、PCR检测和条带分析等,探讨核酸检测技术在科学研究和医学检验中的应用,涵盖一个完整的富含生物学特色的科研过程。该项目在通识课程中的实践,使非生物专业的学生在获得生物学核酸提取相关知识点和实验技能点的同时,了解生物学科研项目的实施过程;同时,通过鼓励学生思考核酸检测技术手段发展的背景、过程和意义,培养学生的发散性思维和创新实践能力,为培养新时代全面创新型人才奠定基础。

微流控芯片环介导等温扩增技术检测3种猪圆环病毒

为建立快速区分3种猪圆环病毒(PCV2、PCV3和PCV4)的现场检测方法,采用微流控芯片环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),收集3种猪圆环病毒临床阳性样本进行核酸提取,与市场上3种猪圆环病毒荧光探针法检测试剂盒进行灵敏度、特异性和重复性同步比对。结果显示:微流控芯片LAMP法在3种猪圆环病毒联检测试中具有非常高的灵敏度,可以在30 min内,实现不低于荧光定量PCR法的敏感性;与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒临床阳性样本均无交叉反应,特异性好;测试3种猪圆环病毒重复性Ct值变异系数(CV)均在2%以下,稳定性好。结果表明:3种猪圆环病毒微流控芯片快速联检技术特异性好、灵敏度高、重复性强,检测速度快,环境要求低,可以满足现场检测的要求,适用于养猪场等场所的猪圆环病毒现场快速检测。本方法的建立为猪相关病原体的现场快速核酸检测提供了有力工具。

超速离心浓缩对提高血液NAT筛查不确定标本鉴别率的临床研究

目的探讨超速离心浓缩(简称超浓缩)血液标本中的病毒对提高三联检核酸筛查阳性、病毒含量低不能常规鉴别标本的可鉴别率。方法30份Roche COBAS s201核酸扩增检测系统筛选出的COBAS TaqScreen MPX HIV、HCV、HBV三项联检核酸阳性,但COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV、HCV及HBV定量试剂原倍鉴别结果均阴性的标本,进行4℃、24600g超速离心1h,浓缩富集病毒后,使用Roche公司的COBASAmpliPrep/COBASTaq-ManHIV、HCV及HBV定量试剂盒进行HIV、HCV及HBV鉴别试验,鉴别阳性的标本,超浓缩处理后用Novartis(原Chiron)公司的PROCLEIX ULTRIO试剂进行相应病毒的鉴别试验加以确证。结果30份RocheMPX核酸筛查阳性、鉴别阴性的标本,经4～10倍超浓缩处理后有23份标本被鉴别为HBV阳性,可鉴别率为76.7%。结论超浓缩处理可解决绝大部分核酸检测三联检阳性但鉴别未果的标本的病毒鉴别问题。

乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品的研制

目的建立乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品,确定其质量标准。方法通过对24份病原体培养物的复核、确证,全基因组测序及基因分型,组成乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品,经多家实验室的协助标定,确定参考品的质量标准,并对参考品进行均匀性及稳定性评估。结果乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品由10份阴性、14份阳性、1份最低检出限和1份精密度样品组成。质量标准为10份阴性参考品应均检出阴性;14份阳性参考品应至少检出13份阳性;精密度考品重复检测10次,要求均为乙型脑炎病毒阳性,且其检测值的CV应不大于5.0%;最低检出限参考品要求1∶102倍稀释及以上浓度时应为乙型脑炎病毒阳性。参考品的均匀性及稳定性均符合要求。结论该参考品可用作乙型脑炎病毒核酸检测试剂的质量控制及评价。

HIV暴露儿童血清逆转影响因素分析

目的研究HIV暴露儿童血清逆转相关影响因素。方法收集2019年1月至2021年12月期间深圳市第三人民医院管理的49例HIV感染孕产妇及所生HIV暴露儿童的一般情况、临床资料及血清结果等。结果49例HIV暴露儿童在出生后48 h、6周、3月龄HIV核酸检测均为阴性。在12、18、21月龄时血清逆转率分别为59.18%、93.87%和100.00%。HIV暴露儿童在12月龄血清是否逆转与母亲分娩方式、抗反转录病毒开始时间、孕期核酸检测结果、CD4^(+)T淋巴细胞计数无关;与HIV暴露儿童的性别、出生胎龄与体重、阻断药物使用种类等也无关。结论未发现12月龄HIV暴露儿童血清逆转的明确影响因素,其3月龄核酸检测与最终血清逆转结果一致性为100%。为尽早排除HIV感染,减少家属顾虑,未来可考虑HIV暴露儿童3月龄前3次核酸阴性结果代替血清逆转。

酶免抗-HCV阳性标本中NAT法及胶体金法检测相关性分析

目的通过比较酶免法(ELISA)及胶体金法检测抗-HCV和核酸(NAT)检测HCV RNA,分析3种检测方法的实际效果,为临床输血安全提供依据.方法选取经2种ELISA法检测均为阳性的献血者标本,同时进行核酸和胶体金法检测,对结果进行分析.结果45例抗-HCV反应性标本,核酸检测阳性率为37.8%,胶体金法检测阳性率为77.8%.NAT显示,在酶免试剂1和试剂2的S/CO值均≤10.00时,核酸均未检出;在S/CO值均>10.00时,核酸检出率分别为70.8%和62.9%.胶体金法检测显示,在酶免1和2的S/CO值为1.00~5.00时,检出率分别为46.1%和40%;在S/CO值为5.01~10.00时,检出率均为75%;在S/CO值>10.00时,检出率分别为95.8%和77.8%.结论随着S/CO值升高,NAT和胶体金检测法的检出率也随之升高;核酸检测法无法替代ELISA法检测HCV,ELISA法检测抗-HCV联合核酸检测法检测HCV RNA检测可提高丙肝检出率.

无偿献血者ELISA-NAT+标本核酸鉴别/拆分结果分析

目的分析无偿献血者ELISA-NAT+标本的核酸鉴别/拆分结果在不同信号比值(SR)/循环周期(CT)值区间内的分布情况,为完善检验策略和给予献血者更加准确合理的告知提供依据。方法本研究将2017年1月-2018年1月102176例ELISA检测无反应性的献血者标本分为A、B两组进行HBV/HCV/HIV三项的核酸定性检测,A组采用盖立复Procleix TIGRIS系统(三联检),B组采用上海浩源CHitas Bss1200系统(8人份混检),对初次检测有反应性的标本分别进行鉴别/拆分试验,最后对结果按区间进行分析。结果A组阳性率(0.46%,185/39884)明显高于B组(0.13%,80/62292)(P<0.05);A组系统中的鉴别率15≤SR<20组明显高于10≤SR<15组(P<0.05);B组系统的拆分率39≤CT值<41组明显低于37≤CT值<39组(P<0.05),CT值<37组和37≤CT值<39组之间的差异不具统计学意义(P>0.05)。A、B组间的阳性率差异具统计学意义,且两种核酸检测系统各自对应的鉴别/拆分率在部分不同SR/CT值区间的差异具统计学意义。结论本研究能够为更加准确合理的告知献血者提供依据,同时,有必要完善检验策略。

植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中的保护效果研究

目的探究植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中对目标核酸的保护效果。方法分别提取绿萝、水稻、竹子3种常见植物中的RNA作为载体RNA,同时以商业试剂Takara载体RNA为对照,提取甲型流感病毒(Flu A)、乙型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSV A)核酸,并利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)定量分析提取得到的病毒核酸浓度,以评估植物RNA在核酸提取中对病毒核酸的保护效果。结果经琼脂糖凝胶电泳检测,所提取植物RNA的28S rRNA、18S rRNA条带清晰明亮,无弥散现象,所得RNA具有良好的完整性。且经验证,植物RNA对病毒核酸扩增无干扰。裂解液中分别加入0、1000、3000、5000、7000、9000 ng绿萝RNA进行Flu A RNA提取时,提取物经RT-qPCR扩增后的Ct值分别为35.06±0.14、33.01±0.42、32.45±0.33、31.95±0.34、31.74±0.28、31.92±0.24,使用Takara载体RNA提取核酸的Ct值为31.96±0.34。Ct值随着绿萝RNA添加量增加而降低,当添加量≥5000 ng时,Ct值接近使用Takara载体RNA的提取组,继续提高绿萝RNA用量,Ct值趋于稳定,且与使用TaKaRa载体RNA的Ct值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。添加5000 ng绿萝RNA与添加0 ng绿萝RNA相比,Ct值相差3.11,根据浓度差等于2ΔCt计算可知添加5000 ng绿萝RNA提取得到的Flu A核酸浓度比不添加载体RNA高了8.63倍。进一步研究发现,添加绿萝RNA、水稻RNA、竹子RNA及Takara载体RNA,提取得到的Flu A、Flu B和RSV A核酸经RT-qPCR扩增后得到的Ct值与不添加载体RNA比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。绿萝RNA作为载体RNA在提取Flu A、Flu B、RSV A混合病毒核酸时,对比无载体RNA的对照组,分别降低了2.61、2.90、1.45个Ct值,即添加了绿萝RNA后提取Flu A、FluB、RSV A所得的核酸浓度分别提高了6.11、7.46、2.73倍。且添加了水稻RNA和竹子RNA提取混合病毒核酸所得的核酸浓度也分别至少提高了2.63倍和2.60倍。结论在病毒核酸提取过程中植物RNA具有保护病毒核酸的作用,可以提高提取得到的目的病毒RNA浓度,可用作病毒核酸提取时的载体RNA,为核酸提取中的载体RNA选择提供更多来源。

丙型病毒性肝炎抗体检测与HCV高敏核酸检测对病毒性丙型肝炎的筛查价值研究

目的通过对本院2019年1月至2022年9月需进行手术、输血或其他侵入性医疗服务的住院患者的HCV血清学抗体及高敏HCV RNA筛查结果进行回顾性分析,探讨丙型病毒性肝炎抗体检测与HCV高敏核酸检测对病毒性丙型肝炎的筛查检测价值。方法对本院相关住院患者进行Elecsys Anti-HCV II或(和)高敏HCV RNA检测,统计分析其检测结果。结果HCV血清学抗体检测22443人次,阳性率为0.68%,阳性COI中位数为38.4(1.0~165)。高敏HCV RNA检测34628人次,阳性率0.30%,阳性病毒载量中位数为1.00×10^(6)IU/mL(3.50×10^(1)~4.00×10^(7)IU/mL)。两种方法学均显示45~59岁人群阳性率显著高于其他人群(P<0.001)。两种检测有重合的样本共17785人次,HCV抗体血清学阳性率为0.70%。高敏HCV RNA阳性率0.22%,如以高敏HCV RNA为丙型肝炎现症感染的标准,HCV抗体血清学检测HCV现症感染的灵敏度为100.00%(95%CI 89.09%~100.00%),特异性为99.52%(95%CI 99.41%~99.61%),现症感染阳性预测期PPV为32.00%(95%CI 23.82%~40.18%),阴性预期值为100.00%。HCV抗体血清学检测COI值与高敏HCV RNA检测的病毒载量无线性相关性,COI<10和COI>100的HCV RNA阳性率低。结论HCV抗体检测和高敏HCV RNA均为有效的丙型肝炎筛查手段,需进一步加强对重点人群的丙型肝炎感染管理。

隐匿性乙型肝炎病毒感染的输血传播风险及防范

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国重大的公共卫生问题,也是输血安全领域的焦点之一。隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)是HBV感染的一种特殊的临床类型,其特征是在血清或肝脏中检测到HBV DNA,但乙型肝炎表面抗原(HBsAg)呈阴性。对献血者进行HBsAg检测尤其是核酸检测(NAT)能有效地控制大多数HBV传播,但是残余传染风险依然存在。OBI献血者是潜在的HBV传染源,含有极低病毒载量的HBV DNA,即使是高度敏感的单人份核酸检测(ID-NAT)也可能是间歇性检测到或无法检测到。目前对于OBI检测缺乏一种标准化的、经过验证的有效方法。为了提高OBI检测的准确度,需要开发更灵敏、标准化和有效的HBsAg、HBV DNA的检测方法;同时还要深入地了解OBI发展机制,准确诊断OBI以提高输血安全性。

改进核酸筛查混检阳性池再检模式的探讨

目的 通过分析核酸筛查混检阳性池CT值分布区间与拆分率的相关性,为改进混检阳性池再检模式,降低输血残余风险提供依据。 方法 回顾性分析2017年1月—2021年12月本站Cobas S201检测系统核酸筛查HBV混检阳性池标本拆分情况,选取影响拆分成功的主要因素CT值,以CT值分布区间为依据制定再检实验方案。针对2022年3月—2023年3月HBV混检阳性池标本,进行Cobas S201和Panther检测系统的同步检测,统计分析该类标本检测结果。 结果 2017—2021年5年间混检阳性池为474个,混检HBV阳性池为324个,占混检阳性池的 68.35% ,其中2017—2020年每年的HBV阳性池占比明显高于HCV和HIV阳性池( P <0.05);5年间HBV拆分阳性池为167个,占混检HBV阳性池的51.54%,拆分阴性池为157个,占混检HBV阳性池的48.46%。5年间HBV拆分阳性池按CT值分为3个区间:CT值≤36、36<CT值≤40和CT值>40,其拆分率分别为95.8%、56.5%和14.8%( P <0.05);拆分阳性和拆分阴性2组中,36<CT值≤40区间混检池数量占比最高分别为80.8%、66.2%,且与其它2区间比较有差异( P <0.05)。2022年3月—2023年3月混检HBV阳性池有65个,CT值≤36区间(5个)和CT值>40区间(12个),经Cobas S201拆分和Panther联检符合率都为100%,36<CT值≤40区间(48个),2种检测方法的符合率为81.25%。Cobas S201首次拆分结果和Panther联检结果不一致有9份标本,有4份标本Cobas S201首次拆分是阴性,同步Panther联检是阳性,4份标本中3份Cobas S201再单检是阳性,1份Cobas S201再单检是阴性,按照制定的再检方案判定规则是9份标本判定为不合格,按照混检阳性池拆分1次阴性即放行的规则至少会有3份标本漏检。 结论 核酸筛查中混检阳性池再拆分阴性的献血者标本占有一定的比例,混检阳性池拆分1次阴性即放行的规则有漏检风险,对这部分标本可以有选择性的(36<CT值≤40区间)进行再检判定结果,既保证了血液安全又节约了再检成本。