人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P的表达鉴定

本研究根据编码A亚型人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus,HRSV)核壳体蛋白(Nucleocapsidprotein,N)和磷蛋白(phosphoprotein,P)的基因序列,各设计一对特异性的引物,应用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得n和p的基因片断,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。获得的重组质粒通过脂质体Lipofectamine2000转染COS-7细胞,72h后再用Westernblot鉴定蛋白的表达。结果显示真核表达载体pcDNA3.1(+)/N和pcDNA3.1(+)/P的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变,利用蛋白印记方法也检测到了N和P的特异性条带。于是我们认为成功构建了含有HRSVN和P编码基因的真核表达载体,在真核细胞内能顺利表达。为进一步开展HRSV反向遗传学等研究奠定了基础。

新城疫病毒V4株NP和P基因及其间隔区序列的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了新城疫病毒(NDV)V4株长约4 200 bp的核苷酸序列,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列中包含有NDV V4株NP基因编码区、NP和P基因间隔区以及P基因的全部核苷酸序列。NDV V4株NP和P基因与其他8个NDV毒株相应部分进行同源性比较,与Quuesland V4株的同源性最高。NDV V4株NP和P基因间隔区序列与其他13株NDV毒株相应部分的比较结果表明,F48E9等强毒株较La sota等弱毒、无毒毒株和试验用V4株在这个区域多了6个碱基,这6个碱基插入的位置在La sota等弱毒、无毒毒株全基因组序列的1647-1648 nt处;参比的14株NDV在这个区域的同源性为63．9％-100％,弱毒株之间的同源性较高,弱毒株与强毒株之间及强毒株之间的同源性差异较大。

新型冠状病毒Wuhan-Hu-1株Np空间结构及其B细胞抗原表位的预测

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)是最新发现的一种可侵染人体的β属冠状病毒,该病毒入侵机体可引发新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19),该疫情的暴发在国内甚至国际上造成了严重影响。核衣壳蛋白(Nucleocapsid phosphoprotein, Np)相较于病毒编码的其它三种结构蛋白保守性更强,在病原诊断、疫苗设计和治疗等方面占据重要地位。预测Wuhan-Hu-1 Np的空间结构及其B细胞抗原表位,为开发SARS-CoV-2的表位疫苗和相关单抗奠定基础。采用MEGA5.05中的Neighbor-joining法构建基于SARS-CoV-2 Np的碱基序列的系统发生树;以SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1株为研究对象,其柔性区段、亲水性指数、抗原指数和蛋白质表面可能性等参数由DNAStar软件中的Protean模块进行分析预测,结合Phyre2在线工具模拟的空间结构,综合预测Wuhan-Hu-1 Np的B细胞优势抗原表位。结果发现:不同地区SARS-CoV-2 Np的碱基序列高度相似(99.6%-100%),Wuhan-Hu-1 Np氨基酸序列长419 aa,其空间构型相对规则,仅含少量α-螺旋而多见β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构;多参数综合分析结果指示,可能的B细胞抗原表位位于52~59、69~75、83~89、106~115、119~124、130~136、154~166、217~227、243~249、267~273、299~315、333~339、347~363、379~385、389~401、403~411氨基酸区段。本研究旨在为开发SARS-CoV-2表位疫苗、快速诊断试剂、单克隆抗体等提供理论信息,为医治COVID-19给予一些新策略。

The nucleocapsid of vesicular stomatitis virus

The nucleocapsid of vesicular stomatitis virus serves as the genomic template for transcription and replication. The viral genomic RNA is sequestered in the nucleocapsid in every step of the virus replication cycle. The structure of the nucleocapsid and the entire virion revealed how the viral genomic RNA is encapsidated and packaged in the virus. A unique mechanism for viral RNA synthesis is derived from the structure of the nuleocapsid and its interactions with the viral RNA-dependent RNA polymerase.

猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR技术扩增了N基因和Vero E6细胞的B23.1基因的cDNA,分别克隆到真核表达载体pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1,获得重组质粒pAcGFP1-C1/N和pDsRed2-N1/B23.1,共转染Vero E6细胞。【结果】Western blots分析表明这些融合蛋白在转染的Vero E6细胞中表达;共聚焦显微镜技术分析表明在共转染Vero E6细胞中猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6细胞核磷蛋白B23.1发生共定位。【结论】为进一步鉴定PEDV N蛋白中核仁定位信号和N蛋白核仁定位机制提供可靠依据。

新冠病毒N基因编码蛋白的生物信息学分析

目的利用生物信息学方法分析预测新冠病毒N基因编码蛋白的结构及抗原表位,为研究新冠病毒靶向药物和疫苗提供理论依据。方法通过NCBI获得新冠病毒核衣壳蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列,采用ORF Finder、Protparam、SOPMA、DTU Health Tech、TMHMM-2.0、Conserved domains、Cell-PLoc 2.0、NetPhos 3.1 Servera、NetNGlyc、SWISS MODE、Immunomedicine Group、IEDB、SYFPEITHI、BLAST、Uniprot等生物信息学软件对新冠病毒N蛋白的开放阅读框、理化性质、亲疏水性、信号肽、跨膜区、结构域、亚细胞定位、磷酸化及糖基化位点、二级结构、三级结构、抗原决定簇、B细胞与T细胞抗原表位、蛋白同源性及相互作用蛋白进行预测分析。结果新冠病毒核衣壳蛋白是由419个氨基酸组成的亲水蛋白,分子式为C_(1970)H_(3137)N_(607)O_(629)S_(7),相对分子质量为45.625×10^(3),理论等电点为10.07,脂肪族氨基酸指数为52.93,平均亲水系数为-0.971;该蛋白二级结构以无规则卷曲居多占55.13%,无信号肽和跨膜区,存在57个磷酸化位点,5个糖基化位点。预测该蛋白有16个抗原决定簇,8个B细胞优势抗原表位,16个CTL细胞优势表位,13个Th细胞表位,与SARS-CoV同源性最高,主要与6种蛋白相互作用发挥功能。结论新冠病毒N基因编码蛋白含有多个B、T细胞优势抗原表位,与SARS-CoV同源性高,可为冠状病毒疫苗的研发提供和理论基础。