保幼激素环氧水解酶基因在蠋蝽滞育过程中的表达模式及其功能研究

保幼激素(juvenile hormone,JH)缺乏是引发昆虫生殖滞育的主要原因,保幼激素环氧水解酶(JHEH)作为JH的主要降解酶,通过调控JH滴度水平在昆虫滞育中发挥重要作用。为研究JHEH在蠋蝽生殖滞育中的调控功能,克隆获得了蠋蝽JHEH基因(AcJHEH),该基因编码452个氨基酸,具有典型环氧水解酶结构特征,无跨膜结构域,存在1个信号肽位点。同源性及系统进化分析结果表明,AcJHEH在不同物种间具有较高保守性,与茶翅蝽(Halyomorpha halys)的JHEH相似性较高,达65.46%。利用RT-qPCR技术测定了AcJHEH在蠋蝽不同组织及滞育不同时期的表达量,发现AcJHEH表达量在滞育诱导期先下降后升高,滞育诱导20 d时表达量最低;滞育初期(诱导40 d)表达量最高,滞育维持期(诱导50~60 d)的表达量稳定在较高水平,与成虫初羽化时水平接近。AcJHEH在滞育蠋蝽的头部表达量最高,其次是中后肠和脂肪体,在卵巢中表达量最低。利用RNAi敲降蠋蝽初羽化成虫的JHEH基因表达后,雌虫体内的卵黄蛋白原(vitelliogenin,Vg)基因表达量上升,卵黄沉积明显,推测滞育诱导期高表达的JHEH基因可能通过抑制Vg基因的表达,抑制卵黄蛋白沉积和卵巢发育,从而促进蠋蝽的生殖滞育。本研究结果为解析JHEH在生殖滞育中的调控作用提供了参考依据。

紫苏磷脂酸磷酸水解酶基因(PfPAH1)的鉴定及功能分析

本文基于紫苏基因组数据筛选获得两条PfPAH1基因序列,分别命名为PfPAH1-1和PfPAH1-2。应用生物信息学工具分析PfPAH1s蛋白理化性质、功能结构域及系统进化。定量PCR(qRT-PCR)检测PfPAH1s在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子的表达谱。进一步克隆到高表达的PfPAH1-1基因的编码序列并进行烟草瞬时转化以鉴定其功能。结果表明,PfPAH1-1和PfPAH1-2基因的开放阅读框(ORF)长度均为2715 bp,编码904个氨基酸残基,含有Lipin_N、Lipin_mid和属于HAD_like超家族的LNS2三个保守结构域。系统进化分析显示紫苏PfPAH1-1蛋白与唇形科植物一串红的SsPAH1亲缘关系最近,其次是葡萄和芥菜。PfPAH1-2蛋白则与唇形科的芝麻SiPAH1亲缘关系最近,其次为油橄榄,紫苏和芝麻均为油料作物,推测PfPAH1-2和SiPAH1可能具有相似功能。qRT-PCR分析表明PfPAH1-1和PfPAH1-2基因均在开花后40 d种子中表达量最高,预示着其可能参与油脂合成积累。烟草瞬时转化揭示过表达PfPAH1-1基因烟草叶片总脂肪酸及中性脂含量均高于野生型烟草,然而磷脂含量降低。

烟草糖苷水解酶GH3基因家族鉴定与表达分析

糖苷水解酶GH3基因家族在植物的糖代谢和生长发育中起着重要作用,而烟草GH3基因家族目前尚未见相关鉴定和分析研究报道。本研究采用生物信息学方法在烟草基因组中鉴定GH3家族基因,并对其在不同组织中及逆境条件下的表达模式进行了分析。结果表明,在普通烟草K326的基因组中共鉴定出35个GH3基因,其中23个被定位在14条染色体上,存在6对共线性基因;GH3家族蛋白均为热稳定性蛋白,其基因上游启动子区均包含多个激素和胁迫响应元件。转录组数据表明,GH3家族基因大多数在烟苗茎尖高表达,少部分在根和茎中高表达,表达量受光照时间影响;烟苗受到干旱胁迫后GH3家族成员都有不同程度的响应。挑选4个NtGH3基因进行qRT-PCR分析,结果表明,NtGH3-5、NtGH3-19、NtGH3-22、NtGH3-26可能参与响应低温以及ABA处理。这可为深入了解烟草GH3基因家族及其功能提供依据。

甲基对硫磷水解酶基因的克隆与融合表达

利用鸟枪法从甲基对硫磷降解菌DLL 1Peudomonasputida)中克隆了甲基对硫磷水解酶基因 (mpd)片段2 5kb ,并进行了测序。通过软件分析开放阅读框和启动子序列 ,表明该序列中最可能为甲基对硫磷水解酶结构基因的阅读框为 76 9～ 1 794区域。软件分析还表明该水解酶前端 4 5个氨基酸为典型的信号肽结构。通过PCR扩增了mpd结构基因 ,亚克隆到表达载体pET 32a中 ,构建了完整的融合表达载体pET MP。转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,在IPTG的诱导下 2～ 4h甲基对硫磷水解酶表达可以达到最高水平 ;同时还研究了乳糖的诱导效果 ,2 %乳糖诱导 2h就可以起到很好的效果。通过PCR反应验证了mpd基因定位于DLL

转基因棉种植对土壤水解酶活性的影响

转Bt基因棉和转Bt+CpTI基因棉种植面积不断扩大,它们种植后杀虫晶体蛋白在土壤中的残留特性及对土壤水解酶活性的影响是环境风险评价的重要组成部分,本文采用盆栽实验的方法对此进行了初步研究。结果表明,转基因棉出苗后生长到30天时可向土壤中释放Bt杀虫晶体蛋白,而双抗棉种植时CpTI杀虫晶体蛋白的释放量与品种有关;转基因棉出苗后30天时,与等价基因系非转基因棉(各对照)相比,转Bt基因棉(“中30”)和双抗棉A(转Bt+CpTI棉“中41”)的种植并未使脲酶、蛋白酶和磷酸单脂酶活性发生显著变化,而双抗棉B(转Bt+CpTI棉“双抗321”)的种植使土壤磷酸单脂酶活性显著下降。从杀虫晶体蛋白的释放和对酶活性的影响来看,双抗棉A的种植对土壤的生物活性扰动更小。

农杆菌介导的细菌阿特拉津氯水解酶基因对水稻的遗传转化

研究构建了植物表达载体p1301-atzA,使来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)AD1菌株的阿特拉津氯水解酶基因atzA受控于CaMV35s启动子下表达。用农杆菌介导法将植物表达载体p1301-atzA导入粳型保持系津稻107中,经潮霉素抗性筛选,得到可育的再生植株。转基因植株总DNA经PCR和Southern检测表明atzA基因已整合到水稻的基因组中。对转基因植株进行除草剂阿特拉津抗性检测,在喷施浓度为0.133％的阿特拉津溶液后,对照植株和敏感植株死亡,而转基因植株表现出对阿特拉津的抗性,保持正常生长,但不同转化株系的抗性表达水平不同。对转基因植株T,代进行的遗传分析表明,外源基因atzA能稳定遗传给后代,且大多数株系的分离比符合3:1。

环氧化物水解酶基因多态与肝癌的遗传易感性

目的 探讨环氧化物水解酶基因 (EPHX1)多态与肝癌遗传易感性的关系。方法 应用PCR RFLP技术检测 88例肝癌患者和 10 4例人群对照的EPHX1基因型。结果 病例组和对照组EPHX1第 3外显子第 113密码子的Tyr/Tyr、Tyr/His和His/His基因型的频率分别为 0 .195、0 .4 0 2、0 .4 0 2和 0 .317、0 .4 2 3、0 .2 6 0 ,两组差异无显著性 ( χ2 =5 .17,P =0 .0 75 ) ;第 4外显子第 139密码子的His/His、His/Arg和Arg/Arg基因型的频率分别为 0 .85 2、0 .136、0 .0 12和 0 .6 83、0 .30 8、0 .0 0 9,两组差异有显著性 ( χ2 =7.92 ,P =0 .0 19)。具有 113His/His基因型者发生肝癌的危险性增加 ,OR值为 2 .38( 95 %CI :1.0 4～ 5 .4 9) ;具有 139His/Arg基因型者发生肝癌的危险性降低 ,OR值为 0 .36 ( 95 %CI:0 .16～ 0 .78)。将EPHX1第 3外显子基因型Tyr/His和His/His视为易感基因型 ,则吸烟与之在肝癌发生中存在交互作用 ,OR值为 3.90 ( 95 %CI :1.31～ 12 .0 2 ) ;将第 4外显子基因型His/His视为易感基因型 ,则吸烟和职业暴露与之在肝癌发生中均存在交互作用 ,其OR值分别为 4 .5 3( 95 %CI:1.5 6～ 13.6 1)和 8.4 4 ( 95 %CI :2 .36～ 31.90 )。结论 EPHX1可能为肝癌的易感基因之一。

臭鼻杆菌腈水解酶基因(bxn)的克隆及其在原核生物中的表达

通过PCR技术从克雷伯氏臭鼻杆菌基因组DNA中克隆到编码腈水解酶的基因(bxn),插入pET28a(+)载体的NcoI和SacI之间,构建了bxn基因的原核生物表达载体pET-BX。通过SDS-PAGE鉴定出重组克隆,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出了一种37.7 kD的特异蛋白,其表达量占宿主菌总蛋白的18.2%。在添加终浓度为4mmol/L的乳糖和28℃培养条件下,重组克隆菌可表达较高产量的特异酶蛋白,可将溴苯腈降解为无毒物质,并具有较高活性。

产OXA-23型碳青霉烯水解酶鲍曼不动杆菌基因研究

目的 了解临床分离 12株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的耐药情况、耐药株来源以及产碳青霉烯酶的类型。方法 收集本院对碳青霉烯类药中介或耐药的鲍曼不动杆菌 12株 ,用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(MIC) ,脉冲场凝胶电泳 (PFGE)分析其同源性 ,并用聚合酶链反应 (PCR)检测分析其耐药基因。结果 12株细菌均为多重耐药株 ,有 9株对亚胺培南耐药 ,6株对美罗培南耐药。对青霉素类、头孢菌素类、复方磺胺甲唑均耐药 ,对氟喹诺酮类和酶抑制剂复合物耐药率最低。 12株PFGE图谱分为A、B(B1、B2 ) 2型 ,以A型为主要流行株 (9株 ) ,主要集中在重症监护病房 (ICU)。PCR检出 12株菌株均携带OXA 2 3基因 ,未能检出OXA 2 4基因。结论 本院碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌流行主要为医院感染所致 ,该流行株呈多重耐药 ,12株菌株均产OXA 2 3型碳青霉烯酶。

表达细菌阿特拉津氯水解酶基因的转基因烟草对土壤中阿特拉津的生物降解

植物修复(Phytoremediation)技术是消除或减少土壤环境中有机污染物的重要手段,本研究采用植物转基因技术对土壤中除草剂阿特拉津的降解进行了探索。通过农杆菌介导将阿特拉津氯水解酶基因AD1-atzA转入烟草中,获得了转基因植株。T1代植株在浇灌了20mg·L-1阿特拉津溶液的模拟污染土壤条件下生长45d,抗性植株的RT-PCR结果证实叶片中阿特拉津氯水解酶基因得到正常转录,液相色谱质谱分析在叶片中检出阿特拉津的水解产物羟基阿特拉津。结果表明,用转基因植物修复阿特拉津污染土壤是值得进一步探索的途径。

尿酸氧化酶与肌酐水解酶融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的构建含尿酸氧化酶与肌酐水解酶融合基因的质粒并转化大肠杆菌,使其能同时分泌该两种酶分解尿酸及肌酐。方法根据GenBank数据库已知的尿酸氧化酶基因设计引物,扩增到去掉终止密码子的尿酸氧化酶基因中,并使其连接到质粒pGM36e上构建成pGM36e-U,然后根据已知肌酐水解酶基因设计引物扩增肌酐水解酶基因,把其连接到质粒pGM36e-U中尿酸氧化酶基因后构建成重组质粒pGM36e-U/C,转化大肠杆菌,筛选鉴定重组大肠杆菌,并进行SDS-PAGE分析。将工程菌于特定浓度肌酐和尿酸的培养基中培养24 h,取培养液测定肌酐和尿酸浓度。结果重组质粒得到大小约1.68 kb基因片段。为尿酸氧化酶及肌酐水解酶之合。转化大肠杆菌后尿酸氧化酶及肌酐水解酶活性得到表达。肌酐分解率提高43.50%,尿酸分解率提高42.32%。结论构建的含复合基因的重组质粒转化大肠杆菌后能表达尿酸氧化酶及肌酐水解酶活性。分解尿酸和肌酐。

诺卡氏菌株C-14-1中腈水解酶基因的鉴定、测序及分析

从腈纶废水中分离到高效降解多种污染物的诺卡氏菌株C-14-1,并对该菌中腈水解酶的基因进行鉴定和测序.利用红球菌中腈水解酶氨基酸保守区设计核苷酸引物,以菌株C-14-1的总DNA为模板,PCR扩增发现一条预期大小的DNA带.Southern杂交显示基因组中存在一个腈水解酶基因.进一步构建基因文库和菌落原位杂交,克隆到一个约4·5kb的DNA片段.DNA序列测定和分析表明,该DNA片段携带长度为1143bp的腈水解酶基因.比对分析表明,该基因与国际上发表的红球菌和诺卡氏菌中的腈水解酶基因高度相似.

产肌酸水解酶基因工程菌的构建

目的构建肌酸水解酶的重组质粒并转化至大肠杆菌,研究其蛋白的表达及活性。方法 1根据Genbank数据库已知的肌酸水解酶(黄杆菌U-188)的基因序列,由上海吉凯生物有限公司进行生物合成,得到肌酸水解酶基因片段b;2根据肌酸酶的基因序列设计引物,聚合酶链反应(PCR)扩增,进行双酶切的回收和纯化,与质粒GV296酶切后进行连接,构建重组质粒GV296-b,分别转化至大肠杆菌DH5a,筛选测序鉴定;3提取重组质粒GV296-b,转入至大肠杆菌BL21(DE3),进行菌液PCR鉴定;4工程菌GV296-b/BL21(DE3),向菌液中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其蛋白表达,并制备粗酶液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分析;5将工程菌GV296-b/BL21(DE3)于含特定浓度肌酸的培养基中培养24 h,取培养液测定肌酸浓度。结果 1成功构建重组质粒GV296-b,将上述重组质粒进行双酶切。电泳显示,目的片段大小约为0.783和1.212 kb,与理论值相符;2重组质粒GV296-b,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后实现高效表达。工程菌GV296-b/BL21(DE3)表达肌酸酶,具有肌酸酶活性,按基因序列图分析肌酸水解酶403个氨基酸,经SDS-PAGE分析酶蛋白的分子量约为43 k D。结论成功构建的工程菌GV296-b/BL21(DE3)能高效诱导肌酸酶的表达,具有肌酸酶活性。

血小板活化因子水解酶基因突变与原发性肾病综合征的相关性

目的研究血小板活化因子水解酶(PAF-AH)基因突变与不同类型原发性肾病综合征(PNS)的相关性。方法94例PNS患儿,依据对激素治疗的效应分为激素敏感型NS(SSNS)组37例,激素耐药型NS(SRNS)组26例,激素依赖型NS(SDNS)组31例,239例健康对照组儿童作为对照,应用聚合酶链反应(PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的方法检测其PAF-AH基因第9外显子-994位点基因型及等位基因频率,同时对各种PAF-AH基因型的PNS患儿的病情反复情况进行对比分析。结果NTNS患儿血浆型PAF-AH基因-994位点基因突变频率显著高于STNS及健康对照组;所有PNS及SSNS、SRNS与健康对照组儿童比较,PAF-AH基因第9外显子-994位点基因突变频率差异无统计学意义,SDNS组突变频率显著高于健康对照及SSNS组;PAF-AH基因第9外显子-994位点基因GT型或TT型第1年内反复次数显著高于GG型者。结论血浆型PAF-AH基因第9外显子-994位点基因突变的PNS患儿在临床类型上多为NTNS,且易于在以后的治疗中出现依赖倾向。

球孢白僵菌体壁蛋白水解酶基因BbCDEP的克隆与分析

从玉米螟虫生真菌球孢白僵菌中分离到体壁蛋白水解酶基因片段BbCDEP,长度为1760bp,包含有3个内含子区段,分别位于331～405,586～646,1157～1223bp的位置,该基因编码了一个由377个氨基酸组成的蛋白,与蛋白数据库中同源蛋白AAL5578.1和AAK70804.1的最高同源性分别为98.9%和98.7%,为研究该基因在致病过程中的分子机理提供理论依据。

巴西橡胶树水解酶基因克隆与表达分析

磷是植物生长发育所需的大量重要元素,而缺磷是提高橡胶产量的重要限制因子,研究橡胶树耐低磷胁迫的分子机制,对提高橡胶树磷养分的利用效率具有重要意义。利用低磷胁迫差减文库获得的EST,通过RT-PCR和RACE技术克隆橡胶树应答低磷胁迫基因,并利用实时荧光定量PCR技术进行表达分析。结果表明,从橡胶树中克隆到1个应答低磷胁迫的水解酶基因HbHyd,全长1860bp,包含1个1479bp的完整阅读编码框(ORF),编码56.1kD(492aa)蛋白,经NCBI同源性分析,HbHyd编码的氨基酸序列与蓖麻水解酶的氨基酸序列一致性为84%。利用荧光定量PCR分析HbHyd的表达水平,可知在低磷磷胁迫处理下,HbHyd在橡胶树根中表达量明显上调。HbHyd基因在橡胶树应答低磷胁迫过程中上调表达,该基因的克隆有助于提高橡胶树磷素吸收利用效率。

三唑磷水解酶基因的克隆及水解产物的确定

利用鸟枪法从三唑磷降解菌株mp-4(Ochrobactrum sp.)中克隆了三唑磷水解酶基因tpd,序列分析发现,该基因与甲基对硫磷水解酶基因mpd的同源性为98%,其结构基因含有996个碱基,除终止密码子外编码331个氨基酸,但该基因编码的酶比mpd编码的酶底物范围更广,不仅能水解甲基对硫磷,而且能高效水解三唑磷.利用克隆到的tpd基因编码的水解酶水解三唑磷,将水解反应产物进行液相色谱-质谱联机分析,发现该水解产物分子量为161,经理论分析确定该水解产物为1-苯基-3-羟基-1,2,4-三唑.

血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性与脑动脉粥样硬化性狭窄的关联性研究

目的研究血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activating factor acetylhydrolase,PAF-AH)基因Arg92His(4,275;G→A)、Ile198Thr(7,593;T→C)、Val279Phe(9,994;G→T)突变与脑动脉粥样硬化性狭窄(cerebral artery atherosclerotic stenosis,CAAS)及狭窄颅内外分布的关系。方法 642例行全脑血管数字减影造影(cerebral digital subtraction angiography,DSA)检查的患者,根据狭窄程度,分为脑动脉狭窄(CAAS)组477例和对照组156例,CAAS组进一步分为3个亚组,单纯颅内动脉狭窄(intracranial atherosclerotic stenosis,ICAS)组,单纯颅外动脉狭窄(extracranial artery atherosclerotic stenosis,ECAS)组,颅内外动脉联合狭窄(intracranial-extracranial artery atherosclerotic stenosis,IECAS)组。比较Arg92His、Ile198Thr、Val279Phe突变基因型及等位基因频率在各组的分布。结果 Arg92His突变基因型及等位基因频率,在ICAS组显著高于对照组(42.6%vs.30.3%;23.3%vs.16.4%)(P<0.05),而ECAS组、IECAS组突变基因型频率(28.7%,26.1%)及突变等位基因频率(17.0%,15.3%)与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Ile198Thr、Val279Phe突变基因型及等位基因频率在ICAS组、ECAS组、IECAS组与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。CAAS组与对照组比较,Arg92His、Ile198Thr、Val279Phe突变基因型及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Arg92His位点突变可能参与了颅内动脉粥样硬化性狭窄的发生。

小麦吸浆虫保幼激素酯酶和保幼激素环氧水解酶基因的克隆及在滞育和变态发育过程中的表达动态

【目的】保幼激素(juvenile hormone, JH)在小麦吸浆虫Sitodiplosis mosellana滞育诱导及滞育后静息状态的维持中发挥着重要作用。保幼激素酯酶(hormone esterase, JHE)和保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)是调控JH滴度的重要降解酶。本研究旨在探讨JHE和JHEH在小麦吸浆虫滞育和变态发育中潜在功能。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从小麦吸浆虫滞育前幼虫克隆JHE和JHEH全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析其核苷酸及编码蛋白特性;采用qPCR技术分析其在小麦吸浆虫滞育不同时期(滞育前、滞育期、滞育后静息期和滞育后发育)3龄幼虫及1龄幼虫到成虫不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹、后蛹、雌成虫和雄成虫)中的表达水平。【结果】克隆获得了cDNA全长分别为3 102和1 980 bp的小麦吸浆虫SmJHE和SmJHEH基因(GenBank登录号分别为MG876768和MG876769),其开放阅读框分别长1 740和1 371 bp,分别编码579和456个氨基酸,预测蛋白分子量分别为65.67和51.65 kD。SmJHE蛋白含有5个JHE家族特有的保守模块,SmJHEH含有催化三联体Asp228, Asp404和His431及组成阴氧离子洞的两个Tyr(Tyr299和Tyr374)和HGWP花样结构。序列比对和进化分析表明,SmJHE和SmJHEH均与双翅目(Diptera)长角亚目(Nematocera)昆虫同源蛋白氨基酸序列一致性较高,亲缘关系最近。不同滞育时期的表达模式表明,SmJHE和SmJHEH在滞育前期(1龄到滞育前的3龄幼虫早期)表达量变化不明显,进入滞育后表达量基本维持恒定,但均在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月最低。发育表达模式表明,幼虫恢复发育后SmJHE表达量逐渐升高,预蛹期达到最高,在雌成虫中的表达量显著低于雄成虫中的;SmJHEH表达量则在预蛹期最低,在雌成虫中最高。【结论】SmJHE和SmJHEH参与小麦吸浆虫滞育调控,其表达量的降低与滞育后静息阶段JH的累积有关;SmJHE在发育过程中表达量的升高可能参与幼虫到蛹的变态,表达量的降低可能与生殖发育有关。

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的克隆和序列分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(SAHH)全长cDNA序列设计引物,以草菇基因组DNA为模板,PCR扩增获得草菇SAHH基因的全长序列,序列分析结果表明,草菇SAHH长度为1868bp,编码430个氨基酸残基,基因由12个外显子和11个内含子组成,将草菇SAHH基因推断的氨基酸序列与其它物种的SAHH基因氨基酸序列进行比较发现,SAHH基因保守性较高。