表达单纯疱疹病毒受体HVEM的黑色素瘤B16-ova-HVEM细胞系的构建及成瘤后oHSV2治疗效果初探

目的构建可被单纯疱疹病毒感染的新型细胞系B16-ova-HVEM,体外验证目的基因的表达并初步探究其成瘤后,应用Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV2)的治疗效果。方法构建表达单纯疱疹病毒受体(HVEM)的质粒载体,脂质体转染B16-ova细胞,嘌呤霉素筛选表达HVEM的阳性克隆。体外验证后进行体内检测,B16-ova-HVEM荷瘤C57BL/6小鼠,成瘤后分为两组,每组5只小鼠,给予oHSV2治疗为oHSV2治疗组,荷瘤未治疗的小鼠为对照组。治疗后测量肿瘤大小,观察小鼠生存期;流式细胞术检测两组小鼠外周血中CD4^+、CD8^+T细胞和髓系来源的抑制性细胞(MDSC)比例变化。结果质粒DNA测序和酶切鉴定结果均显示成功构建含HVEM的质粒;荧光显微镜下可观察到筛选后细胞发绿色荧光;流式细胞术检测筛选后细胞GFP阳性率为98.3%;RT-PCR验证结果显示筛选后细胞含有目的基因HVEM;oHSV2在感染复数(MOI)为0.1、0.5和1的情况下均能明显感染筛选出的细胞;动物实验显示,oHSV2体内治疗后抑瘤效果显著(P﹤0.001);流式检测结果显示oHSV2治疗后小鼠外周血中CD4^+、CD8^+T细胞比例明显高于对照组(P﹤0.01),而MDSC比例明显低于对照组(P﹤0.01)。结论成功构建B16-ova-HVEM细胞系,其既可被OT-1小鼠T细胞特异性识别又可被单纯疱疹病毒感染,为肿瘤特异性免疫治疗和溶瘤病毒联合治疗的研究奠定基础。

oHSV2所携带的Fluc在皮下表达情况的研究

目的检测oHSV2(oncolytic herpes simplex virus type 2,oHSV2)所携带的外源基因萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)能否在BALB/c小鼠皮下表达。方法选取20只雌性BALB/c小鼠,用小鼠结直肠癌细胞(CT26)植瘤10只小鼠,采用瘤内和皮下两种方式给药分别用高剂量和低剂量oHSV2-FLuc,使用小动物活体成像仪观察BALB/c小鼠体内荧光信号表达情况,每隔24h观察一次,持续观察7d。结果BALB/c小鼠经皮下给药后,活体成像系统能够检测出Fluc所发出的荧光信号。结论oHSV2所携带的外源基因可以在皮下正常表达。

溶瘤单纯疱疹病毒激活PBMC抗肿瘤的初步机制

目的:研究重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒激活外周血单核细胞的初步机制,为后续研究中激活的免疫细胞杀伤肿瘤奠定基础。材料:健康志愿者血液样本,灭活oHSV2。方法:灭活的oHSV2与分离的免疫细胞进行共孵育,采用CCK-8试剂盒以及qPCR的试验方法,检测细胞的增殖以及γ干扰素的相对表达量。结果:刺激的后PBMC与阴性对照组相比较,MOI=0.01条件下的细胞增殖具有统计学极显著差异(P<0.001)。经过病毒刺激后的PBMC中γ干扰素的mRNA表达量增高。

重组病毒法捕获宫颈癌循环肿瘤细胞的初步研究

目的构建新的含有表达绿色荧光蛋白(GFP)的单纯疱疹病毒(OHSV2-GFP),初步验证其对循环肿瘤细胞特异性示踪作用。方法采用PCR、分子克隆及同源重组技术,从HG52野生病毒株的基因组中剔除ICP34.5基因并插入GFP表达序列,构建OHSV2-GFP。抽取健康志愿者外周血4mL,将Hela细胞按10、100、500个加入外周血中后,按照MOI=1比例转染重组病毒OHSV2-GFP^+,然后用流式细胞仪进行该方法检出率测定;收集40例正常人、15例宫颈炎患者和20例宫颈癌患者外周血4mL,裂解去除红细胞后,按照MOI=1的比例转染重组病毒OHSV2-GFP^+,24h后收集细胞,流式细胞仪检测CD45^+/GFP^-细胞并计数,初步检测该方法临床应用的可行性。结果将Hela细胞按10、100、500个加入外周血中后,检测结果显示,检出数分别为6.3、61.7、300.5,总体检出率为61.7%,线性回归分析显示应用此方法捕获的CTC数量与预先加的肿瘤细胞数呈线性关系,R^2≥0.95。宫颈癌患者的GFP^+/CD45^-细胞数(10.90±2.3)个明显高于正常人(0.38±0.12)和宫颈炎患者(0.33±0.09)个,差异具有显著性(P<0.01)。结论本研究应用循环肿瘤细胞能够被该重组病毒捕获的特性,建立一种新的CTCs检测技术,并针对此技术的可靠性进行了证实,为进一步的临床应用研究打下了基础。