雌激素介导circZNF423作为ceRNA调控oar-miR-541-3p/CALM3通路促进绵羊成肌细胞增殖

【背景】雌激素是雌性哺乳动物卵巢组织分泌的主要激素,其对肌肉的生长发育起着重要的调控作用,circRNA已被发现参与多种与肌肉生长发育相关的信号通路。【目的】根据团队前期卵巢摘除苏尼特羊与假手术苏尼特羊全转录组整合分析发现circZNF423可作为内源性竞争RNA(ceRNA)调控oar-miR-541-3p/CALM3的表达。为进一步探究雌激素在绵羊肌肉生长中分子机制,通过体外培养绵羊原代成肌细胞,检测成肌细胞中外源添加雌激素介导circZNF423调控oar-miR-541-3p/CALM3对成肌细胞增殖的影响,为进一步研究雌激素及circRNA在绵羊生长发育性状中的作用机制提供理论依据,为绵羊分子设计育种提供新的研究思路。【方法】采集绵羊背最长肌组织,对绵羊原代成肌细胞进行体外分离培养,通过免疫荧光染色、RNA原位杂交(FISH)和核质分离试验确定circZNF423在成肌细胞中的表达位置;RNAhybrid在线软件预测circZNF423、oar-miR-541-3p和CALM3存在结合关系,通过双荧光素酶活性检测和生物素标记的miRNA下拉试验验证circZNF423和oar-miR-541-3p、oar-miR-541-3p和CALM3结合情况;体外构建合成circZNF423过表达或干扰载体、oar-miR-541-3p的模拟物(mimics)或抑制剂(inhibitor)、CALM3过表达或干扰载体,在绵羊原代成肌细胞中进行转染,利用RT-qPCR、Western blot、EdU和CCK-8检测绵羊成肌细胞增殖标志因子的表达和成肌细胞增殖情况;为进一步明确雌激素在绵羊肌肉生长发育中的作用,体外添加不同浓度的外源性雌二醇(E2),利用RT-qPCR、Western blot、CCK-8和EdU检测绵羊肌细胞增殖标志基因的表达变化。【结果】免疫荧光染色显示分离的原代细胞为绵羊成肌细胞,可用于后续功能验证;RNA原位杂交和核质分离试验表明,circZNF423主要在绵羊成肌细胞质中表达。RNAhybrid、双荧光素酶活性检测和生物素标记的miRNA下拉试验结果表明,circZNF423与oar-miR-541-3p、oar-miR-541-3p与CALM33’UTR之间均存在显著的结合关系;抑制circZNF423/CALM3表达或过表达oar-miR-541-3p后,绵羊成肌细胞增殖标志因子PCNA、CDK2和Pax7 mRNA与蛋白表达水平一致,均显著上调(P<0.05或P<0.01);EdU和CCK8结果表明,抑制circZNF423/CALM3表达或过表达oar-miR-541-3p后,绵羊成肌细胞增殖率显著上升(P<0.05);过表达circZNF423/CALM3或抑制oar-miR-541-3p后则相反。添加不同浓度外源雌二醇(E2)后,在浓度为10 nmol·L^(-1)时绵羊成肌细胞增殖标志因子表达最高,显著高于1和100 nmol·L^(-1)的添加浓度(P<0.05或P<0.01);绵羊肌细胞增殖标志因子PCNA、CDK2和Pax7mRNA和蛋白表达水平一致,均显著上调,circZNF423和CALM3的表达量显著降低,oar-miR-541-3p的表达量显著升高(P<0.05或P<0.01);EdU和CCK8结果显示,体外添加雌二醇后绵羊成肌细胞增殖率显著升高(P<0.05)。【结论】绵羊成肌细胞中circZNF423作为ceRNA调控oar-miR-541-3p和CALM3的结合及表达,添加外源雌激素可通过抑制circZNF423/oar-miR-541-3p/CALM3通路促进绵羊肌肉细胞的增殖。这些结果为揭示雌激素及circZNF423在绵羊骨骼肌发育性状中的分子机制提供理论基础。

miR-541-3p靶向SPOCD1基因通过Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探讨miR-541-3p对乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭的影响及其作用机制。方法:将miR-con、miR-541-3p、anti-miR-con、anti-miR-541-3p、si-con、si-SPOCD1分别转染至MCF-7细胞中,分别记为miR-con组、miR-541-3p组、anti-miRcon组、anti-miR-541-3p组、si-con组、si-SPOCD1组;将miR-541-3p质粒分别与pcDNA-con、pcDNA-SPOCD1共转染至MCF-7细胞中,分别记为miR-541-3p+pcDNA-con组、miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1组;转染均采用脂质体法。RT-qPCR检测miR-541-3p和SPOCD1 mRNA表达水平;Western blot法检测包含1个基因的SPOC结构域(SPOCD1)、细胞周期素D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、β-连环蛋白(β-catenin)的表达;MTT检测细胞存活率;Transwell检测细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测miR-541-3p和SPOCD1的靶向关系。结果:与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,乳腺癌细胞MCF-7、T47D、Bcap-37中miR-541-3p表达水平显著降低,SPOCD1表达水平显著升高。miR-541-3p过表达和敲减SPOCD1可降低细胞存活率和细胞迁移、侵袭数量,降低CyclinD1、MMP2、MMP9表达水平。miR-541-3p靶向调控SPOCD1并且SPOCD1高表达能部分逆转miR-541-3p高表达对细胞MCF-7增殖、迁移、侵袭的抑制作用。miR-541-3p过表达抑制Wn/tβ-catenin信号通路激活,SPOCD1高表达能部分逆转miR-541-3p高表达对Wn/tβ-catenin信号通路的抑制作用。结论:miR-541-3p过表达可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与SPOCD1和Wn/tβ-catenin信号通路相关,并为乳腺癌的治疗提供新思路和新靶点。

LncRNA ZFAS1作为ceRNA吸附miR-541-3p调控胃癌侵袭转移

目的:本研究旨在探讨长链非编码RNA锌指蛋白反义链1(ZFAS1)作为ceRNA吸附miR-541-3p对胃癌侵袭转移的影响。方法:qRT-PCR对癌旁组织、胃癌组织以及人胃黏膜上皮细胞株、胃癌细胞株中ZFAS1和miR-541-3p的表达进行检测。验证ZFAS1和miR-541-3p的之间的靶向关系。取ZFAS1表达最高的细胞用于后续试验并转染miR-541-3p inhibitor、ZFAS1-shRNA等。MTT检测细胞增殖,Western blot检测侵袭转移相关因子的表达,Transwell测定细胞侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:癌组织中ZFAS1表达增多而miR-541-3p表达减少,ZFAS1能够靶向抑制miR-541的表达(均P<0.05)。抑制ZFAS1表达能够抑制胃癌细胞增殖、侵袭以及侵袭转移相关因子的表达,诱导细胞凋亡,而敲除miR-541-3p后效果则相反(均P<0.05)。ZFAS1-shRNA对胃癌细胞的作用能够被miR-541-3p inhibitor挽救。结论:ZFAS1能够作为ceRNA吸附miR-541-3p,从而抑制胃癌细胞增殖和侵袭转移,促进细胞凋亡。

miR-541-3p靶向SENP1调控皮肤黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭机制的研究

目的:探讨微小RNA-541-3p(miR-541-3p)对皮肤黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其分子机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blotting)分别检测皮肤黑色素瘤组织中miR-541-3p、SENP1的表达水平;以人皮肤黑色素瘤细胞A375为研究对象,分别将miR-NC、miR-541-3p mimics、si-NC、si-SENP1、miR-541-3p mimics与pcDNA、miR-541-3p mimics与pcDNA-SENP1转染至A375细胞;甲基噻唑基四唑(MTT)检测细胞增殖;Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告实验验证miR-541-3p过表达对野生型和突变型SENP1荧光素酶活性的影响;Western blotting检测细胞周期蛋白1(CyclinD1)、p21、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达量。结果:与正常皮肤组织比较,皮肤黑色素瘤组织中miR-541-3p的表达量显著降低(P<0.05),SENP1 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-541-3p组A375细胞活力显著降低(P<0.05),迁移细胞数与侵袭细胞数显著减少(P<0.05),CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05),p21蛋白水平显著升高(P<0.05);与si-NC组比较,siSENP1组A375细胞活力显著降低(P<0.05),迁移细胞数与侵袭细胞数显著减少(P<0.05),CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05),p21蛋白水平显著升高(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-541-3p能够抑制SENP1的3′-UTR区荧光素酶活性;与miR-541-3p+pcDNA组比较,miR-541-3p+pcDNA-SENP1组细胞活力显著升高(P<0.05),迁移细胞数与侵袭细胞数显著增多(P<0.05),CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著升高(P<0.05),p21蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论:miR-541-3p过表达可靶向抑制SENP1表达从而减弱皮肤黑色素瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力。

CXCR1基因在正常和患临床型乳房炎绵羊乳腺中的表达及功能预测分析

CXCR1基因作为G蛋白偶联受体之一,可与其配体IL-8特异性结合,在炎症反应、肿瘤发生及转移等方面发挥关键调控作用。研究以正常和患临床型乳房炎绵羊(Ovis aries)(共6只,各3只)的乳腺组织作为研究对象,首先采用HE染色法比较观察其组织形态学差异,随后采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CXCR1mRNA的相对表达量,并通过相关生物信息学分析软件对CXCR1基因的靶向miRNAs、涉及到的通路及调控网络等进行预测。HE染色结果显示,与正常乳腺组织(对照组)相比,在患临床型乳房炎乳腺组织(试验组)中结缔组织大量增生,腺泡数量变少且发生萎缩,上皮细胞脱落、腔内有大量炎性细胞浸润。qRT-PCR结果显示,试验组中CXCR1mRNA的表达量较对照组极显著上调(P<0.01)。GO和KEGG分析结果表明,CXCR1基因主要涉及趋化因子-受体相互作用、趋化作用等过程。靶向预测调控绵羊CXCR1基因的miRNAs结果显示,其表达可能受到miR-541-3p、miR-1193-3p等的调控。结果表明,在绵羊临床型乳房炎发生发展过程中,CXCR1基因可能在相关miRNAs的作用下表达上调,进而通过与其配体IL-8结合,趋化炎性细胞向绵羊乳腺感染部位迁移以发挥相应的作用。本研究为进一步深入探究CXCR1基因在绵羊临床型乳房炎发生发展过程中的分子机制提供了参考资料。