暗纹东方鲀冷藏期间细菌群落结构与功能变化

目的:探究暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)冷藏期间的微生物群落结构与功能变化规律,明确贮藏过程的优势菌属。方法:通过高通量测序技术研究冷藏期间(4℃,8 d)暗纹东方鲀细菌群落结构组成与变化规律,利用Tax4Fun2软件进行细菌群落功能预测,并测定其挥发性盐基氮(Total Volatile Basic-N,TVB-N)、pH、感官评分等指标变化。结果:高通量测序表明贮藏期间样品细菌群落发生显著变化,初期的主要菌属有不动杆菌属(Acinetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)等,贮藏后期假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度增至91.7%以上,成为优势菌属。贮藏初期α多样性指数较高,贮藏后期明显降低。细菌群落功能预测结果显示贮藏后期的氨基酸代谢、细胞交流、膜运输等功能通路丰度升高。贮藏后期样品pH、挥发性盐基氮值、菌落总数呈上升趋势,感官评分呈下降趋势。结论:样品贮藏过程中,微生物群落结构与功能发生明显演替,假单胞菌属(Pseudomonas)是贮藏过程中的优势菌属;该结果可为暗纹东方鲀后续相应保鲜技术的开发提供理论指导。

半咸水人工湿地净化越冬养殖循环水的效果

为拓展人工湿地在水产养殖上的应用,该文研究了半咸水人工湿地的循环水越冬系统中暗纹东方鲀越冬养殖效果和净化效能。结果表明,经过166d越冬养殖,暗纹东方鲀越冬成活率(76.94±13.87)%,饵料系数5.49±1.77。在无任何外源能源加温的情况下,系统水温保持在暗纹东方鲀幼鱼的生存最低温度以上。在半咸水环境下(7.6‰～9.9‰),人工湿地对养殖水有良好的净化效果:总氮去除率为30.5%、总氨氮为69.6%、亚硝酸盐为96.1%、硝酸盐为9.7%、总磷为18.4%、COD为38.8%、总悬浮物为79.7%,循环水经过人工湿地后水质符合国家渔业用水标准;越冬期间,越冬养殖池水质状况良好;除TN和NO3-N在越冬期间的去除率比在夏季的明显低外,其他主要污染物的去除率与夏季比较没有明显变化。在试验负载范围内,系统去除量随进水污染负载量的增加而增加;通过建立预测模型预测出湿地养殖面积比值0.36～0.97,与实际值1.26相比,养殖密度尚有提高的空间。因此,人工湿地能持续有效地去除暗纹东方鲀越冬循环水养殖系统中的主要污染物,说明该系统能在越冬养殖生产实际应用。

暗纹东方鲀致病性维氏气单胞菌的分离鉴定

从濒死的暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)体内分离到一株优势菌株,经形态观察、生化、16 S rDNA聚合酶链式反应(PCR)以及人工感染健康暗纹东方鲀和ICR小鼠等试验可知,该菌对小鼠和暗纹东方鲀半数致死量(LD50)分别为2.26×106CFU/mL、5.96×104CFU/mL;其16 S rDNA序列与维氏气单胞菌具有高度的同源性,根据该菌的形态特征、生理生化特性,初步鉴定该菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),命名为NT-HV。选择9种水产常用药物进行药敏试验,结果显示该菌对氟苯尼考、复方新诺明、新霉素、氧哌嗪青霉素敏感,对养殖场常用的四环素、强力霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素不敏感,提示在药物的使用过程中应注意药物的浓度和合理轮换。

暗纹东方同工酶生化表现型的研究

利用聚丙烯酚胺凝胶垂直平板电泳方法，对暗纹东方的心、肝、肾，肌、性腺５种不同组织的７种同工酶（ＥＳＴ、ＬＤＨ、ＰＯＤ、ＭＤＨ、ＳＯＤ、ＳＤＨ、α－ＡＭＹ）进行了研究，讨论了各同工酶的基因表达谱式，观察到ＥＳＴ同工酶存在着多态现象；ＬＤＨ同工酶有二个基因位点，但只表现３条带，Ａ与Ｂ亚基的结合受阻；ＭＤＨ同工酶存在性别差异，说明决定ＭＤＨ同工酶表达的因素在不同性别中存在差异；ＳＯＤ同工酶有３个基因位点。各同工酶酶谱稳定，有组织特异性，倡ＥＳＴ、ＭＤＨ、ＳＯＤ、ＰＯＤ同工酶在各组织器官中又表现出较大的一致性，有利于物种的鉴定。α－ＡＭＹ与ＳＤＨ只在个别组织中有活性，可能与特定组织与器官的形态发生与机能分化有关。

暗纹东方鲀线粒体COIII克隆及序列分析

克隆并测定了暗纹东方鲀线粒体基因组(m tDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(CO III)及其下游70 bp的tRNAG ly序列。CO III基因编码框包含786个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质。鱼类CO III的序列组成对A+T核苷酸的偏倚程度比较低。通过暗纹东方鲀与GenBank中8个目12种鱼类的CO III序列同源性比较,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的CO III基因具有较高的同源性。根据暗纹东方鲀与鲀目其他5种鱼的CO III基因序列所建立的进化树,与传统的分类地位相吻合。推定的tR-NA的二级结构具有典型的三叶草型结构。根据CO III序列构建的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应综合考虑物种遗传变异的特点。

暗纹东方鲀mtDNA的分离纯化及其细胞色素b基因的分子克隆

利用改进的差速离心法和碱裂解法制备并分离纯化了暗纹东方mtDNA,测得分子大小为19.4Kb。用线粒体特异染色法跟踪和监测线粒体提取,结果表明,25000～35000g能获得90%以上的高得率。利用制备纯化的mtDNA,已首次克隆了暗纹东方细胞色素b基因(cytb)。

暗纹东方鲀高效健康养殖模式

暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)高效健康的养殖模式就是利用河鲀在长江内的生态和生理洄游规律,模拟河鲀生殖洄游的历程,在每一养殖阶段充分考虑河鲀在自然状态下生态系统的改变和生理系统的调节,长江环境因素的改变对河鲀生长和品质的影响,以及河鲀生存环境内的物质流动和能量循环因素。通过探索研究,该一体化模式养殖的河鲀品味更鲜,并且生态、安全。

暗纹东方鲀Hepcidin基因的扩增及序列分析

利用聚合酶链式反应,首次从暗纹东方纯基因组DNA中扩增Hepcidin基因的部分序列,序列分析表明,不同鱼类之间的Hepcidin基因DNA序列之间的遗传距离为0.33～1.08,所获得的Hepcidin序列,为进一步研究暗纹东方纯中Hepcidin基因的作用机制提供了基础。

暗纹东方鲀几种常见病原菌防治药物的筛选

为预防和治疗暗纹东方鲀养殖过程中出现的各类细菌性病害,从各地养殖的患病暗纹东方鲀的肝脏、脾脏等部位及腹水中分离出10株不同种属的病原微生物,分别属于豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、脆弱气单胞菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、海鱼弧菌、副溶血弧菌、梅氏弧菌、肺炎克雷伯菌、类志贺邻单胞菌。具有一定的普遍性和代表性。并对致病菌进行防治药物的筛选,药敏试验结果表明新霉素和氟嗪酸等对暗纹东方中存在的病原菌具有普遍的杀灭效果。

温度对暗纹东方鲀和菊黄东方鲀幼鱼瞬时耗氧速率的影响

采用密闭呼吸室法,研究了不同温度(11、15、19、23、27和31℃)下暗纹东方鲀和菊黄东方鲀幼鱼(约20 g)单位体重瞬时耗氧速率的变化规律,及其与溶氧水平的关系。结果表明:暗纹东方鲀和菊黄东方鲀幼鱼瞬时耗氧速率(V)均随实验时间(t)增加而降低,且呈现良好的幂函数负增长相关(V=a tb,r2>0.98,P<0.01);在适宜溶氧范围内,暗纹东方鲀和菊黄东方鲀幼鱼属于顺应呼吸型,V随溶氧水平降低而降低,但在临近临界点时,暗纹东方鲀和菊黄东方鲀幼鱼耗氧率均表现为"调节管理"模式,即幼鱼用增加呼吸频率来保持一定的耗氧率,以维持基本的生命活动,而V与溶氧水平(DO)呈现良好的二次函数关系(r2>0.95,p<0.01);暗纹东方鲀和菊黄东方鲀幼鱼耗氧率均随水温升高而升高,呈现良好的直线增长相关(r2>0.95,P<0.01);在常规池塘养殖水温范围内,暗纹东方鲀幼鱼的耗氧率比菊黄东方鲀高;暗纹东方鲀和菊黄东方鲀幼鱼Q10值分别是2.84和2.65。建议在暗纹东方鲀和菊黄东方鲀的实际养殖和运输过程中,当溶氧水平低于3 mg/L时,应及时启动急救措施。

养殖暗纹东方鲀肌肉中呈味肽的分离鉴定

本文旨在从生鲜暗纹东方鲀肌肉中提取呈味肽从而对暗纹东方鲀肌肉中的呈味肽的结构特性进行相应研究。将生鲜养殖暗纹东方鲀肌肉水提物经Sephadex G15凝胶柱分离,得到3个多肽组分(分别为0-F1、0-F2和0-F3),感官评价结合电子舌选择出具有最强烈的鲜味和kokumi感的组分0-F1。采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对其进行进一步分离得到2个组分0-F1-1和0-F1-2,电子舌鉴定显示0-F1-1组分有较强的鲜味。最后利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对RP-HPLC分离得到组分0-F1-1中呈味肽氨基酸序列进行测定,鉴定得到一种新的呈味七肽结构:Pro-A-Ala-B-Met*-Cys-Arg(810.9046 Da,A和B均为氨基酸代码,Met*表示氧化型甲硫氨酸)虽然肽段中含有大量的疏水性氨基酸,但该肽不具有苦味,而且有显著的浓厚感,其中含有的Cys残基可能是其具有kokumi感的关键。

热加工暗纹东方鲀肌肉中呈味肽分离鉴定及呈味特性研究

为明确养殖暗纹东方鲀煮制时关键呈味肽的结构序列,本文对热加工暗纹东方鲀肌肉中呈味肽进行分离鉴定并对其呈味特性进行研究。热加工暗纹东方鲀肌肉水提物经超滤(3 ku)、纳滤(200 u)及Sephadex G-15凝胶过滤色谱分离得到4个多肽组分(F1、F2、F3和F4),感官评价结合电子舌分析筛选出滋味特性最强组分F2。利用半制备RP-HPLC对F2组分进一步分离得到3个组分(F2-1、F2-2和F2-3),电子舌评价F2-1组分鲜味较强。对组分F2-1中呈味肽的氨基酸序列采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS/MS)进行测定,得到了两种新的呈味五肽和六肽结构:Cys-Ala-Leu-Thr-Pro(CA,503.9253 u)及Arg-Pro-Leu-Gly-Asn-Cys(RP,659.7747 u),2条肽链中均含有的亲水性Cys残基,可能是造成肽具有浓厚感和鲜味的关键。两个肽段经固相合成后测定其呈味特性,肽段RP具有较强鲜味,且肽段RP还与氯化钠和谷氨酸钠具有滋味协同作用,可增强鲜味强度。

结合感官评价与电子舌技术优化酶水解养殖暗纹东方鲀肌肉制备呈味肽

国内外关于河豚滋味的研究主要集中在游离氨基酸、无机离子、核苷酸及其关联物上,而对构成其鲜美浓郁和圆润香滑味感的呈味肽研究较少。因此应用酶生物技术挖掘滋味特性突出的暗纹东方鲀肌肉呈味肽,并应用于食品中具有重要的研究意义与潜在的经济价值。以养殖暗纹东方鲀肌肉为原料,采用中性蛋白酶、风味蛋白酶、水解蛋白酶及复合蛋白酶制备呈味肽,以水解度、寡肽含量和电子舌结合感官评价的方法筛选不同酶解条件下的最优酶制剂。结果表明:风味蛋白酶酶解液水解度最大而水解蛋白酶酶解液寡肽含量最高;电子舌能够明确区分出不同蛋白酶酶解液;电子舌分析结果与感官评价结果存在一定的相关性,但电子舌提供的鲜味、咸味和酸味相对强度与感官评定的结果存在一定的差异。最终确定中性蛋白酶为酶解暗纹东方鲀肌肉制备呈味肽最佳酶制剂。

暗纹东方鲀立体种养模式和单养模式的水质变化及养殖能效比较

为解决暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)单一品种的池塘养殖瓶颈问题,开发和建立多物种、多营养层次的生态立体种养池塘生态系统,于2019年研究了暗纹东方鲀(1.2万尾/hm^(2))、凡纳滨对虾(Litopeneaus vannamei)(24万尾/hm^(2))和蕹菜(Ipomoea aquatica Forsk)的立体种养模式与暗纹东方鲀传统单养模式(1.5万尾/hm^(2))的水质变化及养殖能效差异。结果显示:暗纹东方鲀立体种养模式和传统单养模式池塘水体的pH、总氨氮(TAN)、亚硝酸氮(NO_(2)-N)和硝酸氮(NO_(3)-N)等水质指标数值保持在较理想范围内,这些指标中除了7月8日立体种养模式的NO_(3)-N显著低于传统单养模式外,其他在两种模式之间无显著性差异。立体种养模式的叶绿素a质量浓度明显低于传统单养模式。两种模式的总氮均值分别为1.38~3.96 mg/L和1.04~3.20 mg/L,养殖中后期(7月24日—10月11日),立体种养模式的总氮高于传统单养模式。立体种养模式的总磷(TP)变化随养殖时间呈现缓慢平稳上升趋势(0.26~0.42 mg/L);而传统单养模式总磷质量浓度在养殖中期较高、前期后期较低。除了5月6日监测化学耗氧量(COD)质量浓度相对较高外,其他监测的时间点两种养殖模式的COD质量浓度相对较稳定,均值为6.79~10.24 mg/L和6.83~9.15 mg/L,两模式间均无显著性差异。固体总悬浮物(TSS)质量浓度总体较高,特别是6月13日的水源、7月24日及8月19日的传统单养模式和9月15日的立体种养模式的TSS质量浓度均超过150 mg/L。各监测时间点的TSS质量浓度在两种养殖模式之间无显著性差异。两种模式暗纹东方鲀的养殖有助于池塘水体的pH、TAN、NO_(2)-N和NO_(3)-N的净化,对水体中总磷(TP)和TSS的影响不明显,但会造成水体中总氮(TN)和COD质量浓度升高。立体种养模式和传统单养模式的暗纹东方鲀生长没有显著性差异,放养密度(1.2万~1.5万尾/hm^(2))没有造成暗纹东方鲀生长的空间胁迫。除了立体种养模式的暗纹东方鲀的单位产量(3426.0 kg/hm^(2))显著低于传统单养模式(4055.7 kg/hm^(2))外,立体种养和传统单养模式的暗纹东方鲀的出池规格(293.30 g/尾和297.53 g/尾)、成活率(97.38%和94.60%)以及饵料系数(2.83和2.91)均无显著性差异。立体种养模式下套养的凡纳滨对虾生长性能良好:产量为3056.6 kg/hm^(2),规格为22.48 g/尾,存活率为78.17%,饲料系数为0.68,鱼虾叠加后的饲料系数总体为1.39。相对于暗纹东方鲀传统单养模式,立体种养模式在养殖尾水排放减少11.1%的前提下,每公顷增效87675元,每667 m^(2)增效5845元。