Simplified methods to isolate,culture and purify olfactory ensheathing cells

Conventional methods for harvesting, culturing and purifying olfactory ensheathing cells are complicated, time-consuming, and poorly reproducible. Olfactory bulbs were detached from adult Sprague Dawley rats and olfactory ensheathing cells were isolated using shearing, dispersion processes. After the primary cultures reached confluence, the cells were purified using a three-step process. The olfactory ensheathing cells attached and grew rapidly. The purity of the olfactory ensheathing cells increased following the three purification steps, eventually exceeding 95%. These cells could be maintained for an extended period time in culture. This simple, inexpensive, reproducible method of harvesting, culturing and purifying olfactory ensheathing cells shortens the culture cycle and provides sufficient olfactory ensheathing cells of controllable purity.

成年大鼠嗅球成鞘细胞的原代培养及形态学研究

目的探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)分离与纯化培养方法并对形态学进行研究。方法取材后采用差速贴壁和阿糖胞苷(Arac)抑制相结合的纯化培养方法培养嗅鞘细胞,并分不同阶段进行观察和NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定。结果成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形三种类型,突起细长编织成网状为其特点。结论差速贴壁和Ara-c抑制相结合的纯化培养方法兼收了两者的优点,实践证实是一种简单经济而又有实效的嗅鞘细胞培养方法。

成年大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的 在嗅球成鞘细胞 (OECs)移植到脊髓可有助于损伤神经纤维再生的基础上 ,分别对嗅球和嗅粘膜的OECs进行培养 ,探索自体嗅粘膜作为OECs供体的可能性。 方法 根据OECs、成纤维细胞和星形胶质细胞贴壁时间的不同 ,采用差时贴壁方法分离出OECs,培养 14div后进行NGFRp75和GDNF的免疫细胞化学染色。 结果 按形态学和免疫组织化学特性 ,培养的嗅球和嗅粘膜OECs可分为 3类 :双极细胞、三级细胞和扁圆细胞 ,其中以双极细胞最多。嗅粘膜的双极成鞘细胞的突起更加细长。 结论 差时贴壁细胞分离法是一种简单、经济、实用的成鞘细胞分离方法。鼻腔嗅粘膜OECs的形态学和免疫细胞化学特性与嗅球OECs基本相同 。

大鼠嗅球成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的 探讨大鼠嗅球成鞘细胞 (Olfactoryensheatingcells ,OECs)分离与培养的方法。方法 无菌条件下嗅球置于少量人工脑脊液中 ,用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压 ,得片状组织块 ,胰酶消化 ,吹打 ,细胞悬液进行培养。结果 本方法分离、培养的OECs具有双极或多极突起 ,且突起十分细长 ,神经生长因子受体和胶质纤维酸性蛋白免疫组化呈阳性。结论 该方法简便易行 ,为深入研究OECs神经生物学特性。

嗅球神经元的体外培养研究

目的 :建立稳定的、产出率高的嗅球神经元离散细胞培养系统。方法 :取出生后5～6d大鼠的嗅球于体外培养。48h后随机分为对照组和阿糖胞苷(Ara -C)组连续培养14d。动态观察细胞生长情况 ,进行免疫细胞化学染色。结果 :嗅球神经元可以在体外培养成功 ,且对神经元有特异性的标志蛋白抗神经丝蛋白 (NFP)呈阳性反应。加入抗有丝分裂剂Ara-C后2组标本计数第1d差别无统计学意义 (P>0.05) ;第5,7,14dAra-C组较对照组明显增高(P<0.01)。其神经突生长指数随着时间的延长而增长 ,于7d后逐渐下降。结论 :在有血清的培养条件下 ,离散后的嗅球神经元仍可在体外存活 ,并有神经突生长、标记蛋白的表达。为生理学、分子生物学及药理学研究提供了一个有用的实验模型。

大鼠嗅球神经干细胞培养

目的 建立大鼠嗅球神经干细胞 (neuralstemcells,NSC)体外培养方法 ,研究其增殖和分化特性。方法 采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养新生第 1天和成年大鼠嗅球NSC ,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSC及自然分化为特异性神经细胞的类型 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定嗅球NSC的生长曲线。结果 从生后第 1天和成年大鼠嗅球分离、培养出表达巢蛋白(nestin) ,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSC。生后第 1天和成年大鼠嗅球的神经球形成率分别为 2 0 %～ 30 %和 0 1%。嗅球NSC的增殖依赖表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (fibroblastgrowthfactor basic,bFGF) ,其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF。结论 从生后第 1天和成年大鼠嗅球可以培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSC。

阿糖胞苷在大鼠皮质神经元细胞培养中的适宜介入时间

背景:由于中枢神经系统疾病研究需求,实验室常用有毒性的阿糖胞苷获得纯度较高的神经元细胞,然而阿糖胞苷的介入时间鲜见研究。目的:验证终浓度为10μmol/L阿糖胞苷在大鼠皮质神经元原代细胞培养中的适宜介入时间。方法:采用神经元专用培养基Neurobasal+B27进行大脑皮质组织原代神经元培养,分别于接种细胞后12,24,36,48 h加入终浓度为10μmol/L阿糖胞苷。每48 h半量换液。于7 d后倒置的显微镜下观察神经元形态;采用免疫细胞化学的方法对神经元特异性烯醇化酶进行免疫化学染色,鉴定神经元细胞的纯度和成熟度;计算机多功能图像分析系统对所有神经元特异性烯醇化酶阳性细胞进行形态学计量分析。结果与结论:(1)接种细胞后24 h加入阿糖胞苷,神经元纯度在90%以上,分化成熟神经元细胞占比89.00%,神经元细胞胞体面积最大,突触最长,胞质透亮,核大而明显,细胞体周围折光性强,立体感强,突起三四个,具有三四级分叉,形成良好的网络结构,非神经元细胞较少,神经元纯度及细胞状态最佳;(2)结果表明,阿糖胞苷介入培养过程越早,神经元细胞纯度越高,但阿糖胞苷对神经元细胞分化成熟的影响也会越明显;采用neurolbasal培养基,于接种细胞后24 h加入阿糖胞苷,可以获得理想纯度,成熟度较好,生长状态较好的大脑皮质神经元。

嗅成鞘细胞提取液对阿尔茨海默病脑移植的影响

目的探讨嗅成鞘细胞提取液对阿尔茨海默病(AD)脑移植的影响。方法SD大鼠双侧海马注射Aβ1-40,建立AD大鼠模型。实验动物分为四组:正常对照组、空白对照组、人工脑脊液移植组、嗅成鞘细胞OECs提取液移植组,每组10只。两移植组分别加用人工脑脊液、OECs提取液培养胆碱能神经元,并移植到AD模型大鼠。运用行为学测试、NADPH-d组化、刚果红组织学染色结合积分吸光度测定等技术,观察、比较各组AD模型大鼠移植2个月后学习记忆能力、一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元数以及老年斑的变化。结果①行为学测试:人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组大鼠达到学会标准所需训练次数(TN)、错误反应次数(EN)、潜伏期(D)、全天总反应时间(TRT)少且短于空白对照组(P<0.05);OECs提取液移植组更为明显,与人工脑脊液移植组之间有显著差异(P<0.05)。②NADPH-d组化反应:人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组NOS阳性神经元数较空白对照组明显增多(P<0.05),且前两组之间有显著性差异。③刚果红染色:SP积分吸光度测定,三组间均有显著性差异(P<0.05),OECs提取液移植组SP-IA值最小。结论OECs提取液能明显提高AD脑移植的效果。

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的 建立胚胎大鼠嗅神经干细胞 (NSCs)体外培养方法 ,研究其增殖和分化特性。方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎 14d(E14 )大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型 ,测定NSCs的生长曲线。结果 从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin ,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs。嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子 (EGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) ,其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF。结论 从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs。

嗅鞘细胞与大鼠尾状核神经元共培养的实验研究

目的观察嗅鞘细胞对大鼠尾状核神经元生长的影响。方法嗅鞘细胞与大鼠尾核神经元在无血清培养液中共培养,观察神经元生长变化。结果神经元与嗅鞘细胞共培养下神经元生长良好,轴突延长并形成网络状。结论嗅鞘细胞与大鼠尾状核神经元共培养可促进神经元生长。

毒性损伤大鼠耳蜗核移植嗅球神经前体细胞的初步观察

目的体外培养大鼠嗅球神经前体细胞,并移植到谷氨酸诱导损伤的耳蜗核,观察其生存、分化过程。方法嗅球神经前体细胞取自孕15d胚胎大鼠,免疫荧光染色鉴定。耳蜗核定位注射谷氨酸制成损伤模型。伤后7d移植标记的神经前体细胞,不同时间测定听性脑干反应并取材观察移植细胞的存活及分化。结果巢蛋白阳性的嗅球神经前体细胞在体外可自我复制传代,并分化出神经元和神经胶质细胞。谷氨酸损伤和前体细胞移植均造成听性脑干诱发反应(ABR)阈值升高,并有部分的恢复。免疫荧光技术发现耳蜗核中Hoechst33342分别和神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、谷氨酸双重标记的移植细胞。结论嗅球神经前体细胞移植耳蜗核短期存活良好,所分化出的神经元可表达听觉神经递质。

大鼠嗅球神经干细胞的超微结构

目的研究体外培养的大鼠嗅球神经干细胞(neuralstemcell,NSC)的超微结构。方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养出生后第1天大鼠嗅球NSC,分别于培养后1周,1个月及2个月收集NSC,2.5%戊二醛固定,行扫描电镜及透射电镜观察。结果体外培养的NSC呈圆形或椭圆形,表面有微突起或微绒毛,细胞核浆比例高,稀少的细胞浆中有多少不等的未成熟线粒体、核糖体及高尔基复合体。不同培养时期的神经球内未分化NSC的结构大致相同,均有分裂增殖细胞及少数凋亡细胞。培养1～2个月后出现存在粗面内质网及粗长突起的分化细胞。相邻分化细胞的突起间有缝隙连接。结论体外培养的大鼠嗅球NSC保持原始细胞的形态和结构,并能分化成神经细胞。

增强声环境中嗅球神经前体细胞在耳蜗核的迁移

目的观察增强声环境中移植到大鼠耳蜗核的嗅球神经前体细胞的迁移特点,是否产生部位特异性的修复过程。方法培养嗅球神经前体细胞取自孕14-16d胚胎大鼠,荧光染色Hoechst33342标记后移植到成年大鼠的耳蜗核内侧缘。移植大鼠分为A、B两组,A组置于增强声环境,B组在正常环境中饲养。14d取材观察移植细胞的迁移和分化。结果A组移植细胞有沿听觉神经通路移动的趋势。免疫荧光技术观察到Hoechst33342和神经元核蛋白(NeuN)、谷氨酸阳性三重标记的移植细胞。结论嗅球神经前体细胞移植耳蜗核短期存活良好,增强声刺激可能促进前体细胞在听觉系统的迁移。

嗅上皮的组织块培养法

目的建立并优化组织块法嗅觉受体神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)原代培养体系。方法以鼠尾胶原为培养底物,取新生小鼠鼻中隔和筛甲的嗅上皮进行原代培养。观察包括ORNs在内的各种细胞的形态和分布特点,经免疫组化和扫描电镜证实本原代培养体系内各种细胞的属性以及ORNs的分化程度。结果组织块培养法所得为一混杂的培养体系,除ORNs外还有基底细胞、嗅鞘细胞、纺锤形细胞及成纤维细胞等。其中基底细胞和纺锤形细胞在形态和免疫表型上均具有ORNs前体细胞的特点。优化培养体系后,可得到分化成熟的ORNs并可在体外稳定存活9天以上。结论本培养方法避免了使用消化酶,可以稳定的得到分化成熟的ORNs。

新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的体外培养和纯化方法,为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs,比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果,根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度,同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞,其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势,三种纯化方法均能使接种14 d后的OECs纯度均值大于75%。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的;在脊髓损伤再生研究中,较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法,差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。

嗅鞘细胞对培养脊髓神经元生长状态的影响

目的研究嗅鞘细胞(OECs)对体外培养脊髓背根神经节神经元生长状态的影响。方法取新生大鼠脊髓背根神经节细胞与嗅鞘细胞共培养,在显微镜下观察神经元生长发育情况,染色后进行细胞计数,并测定细胞活性。结果共培养组细胞密度明显高于对照组,神经元胞体大而饱满,突起较长,细胞活性较高。结论嗅鞘细胞可明显促进体外培养脊髓背根神经节神经元的生长,提高细胞活性。

胎鼠嗅球分离培养出神经干细胞的研究

目的研究胎鼠嗅球中分离培养产生神经干细胞(NSCs)的情况。方法取孕16～18d的孕鼠,取胎鼠的嗅球,用含10%FCS的培养基培养传代分离出的细胞,免疫细胞化学方法鉴定培养和传代出的细胞,对染色阳性的细胞计数检测纯度。结果P75染色阳性证明分离培养的细胞为嗅鞘细胞(OECs);来源于嗅球的细胞培养出的神经球行Nestin染色阳性证明为NSCs;传代OECs纯度为95%￣98%。结论胎鼠嗅球中可分离培养出NSCs,OECs可稳定传代,可以作为移植用的种子细胞。

嗅鞘细胞体外诱导神经干细胞分化的实验研究

目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)体外诱导神经干细胞(neuron stell cells,NSCs)分化的作用。方法:分别从3月龄SD大鼠的嗅球和新生SD大鼠的海马中分离OECs及NSCs,进行体外分离、培养及免疫荧光鉴定。构建OECs与NSCs共培养体系,分为3组,纯化培养的OECs+NSCs组,未纯化培养的OECs+NSCs组,单纯NSCs组。共培养后4、8、12d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率。结果:经P75和S100双重免疫荧光鉴定所培养的细胞为OECs,经巢蛋白抗体(Nestin)免疫荧光鉴定所培养的细胞为NSCs。荧光显微镜观察可见被特异性烯醇化酶-异硫氰酸荧光素(NSE-FITC)荧光标记的神经元大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突。在各时间点,共培养组中可见到多个神经元聚集生长,神经元数目明显多于单纯NSCs培养组,而共培养组之间无明显差别。共培养后12d,共培养组中NSCs分化为神经元的百分率大约为23%,而单纯NSCs培养组约为4%。在各时间点,共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异(P<0.001),而共培养组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:OECs在体外能够有效诱导NSCs向神经元转化。

C57BL/6-gfp小鼠嗅球NSC培养及定位注射方法的建立

目的建立一套稳定的绿色荧光蛋白转基因小鼠(C57BL/6-gfp)嗅球神经干细胞(NSC)体外培养的方法,并初步应用于定位注射试验,为干细胞移植治疗神经性耳聋的实验研究奠定基础。方法培养C57BL/6-gfp小鼠胚胎嗅球NSC,传代并进行分化实验,鉴定后将其立体定位注射于大鼠耳蜗核。结果所培养的NSC生长良好,可稳定传代,能够分化为三种神经细胞。定位注射后可在局部见到绿色荧光阳性的细胞团。结论该方法培养的C57BL/6-gfp小鼠胚胎嗅球NSC可稳定传代并可作为荧光标记细胞进行移植试验。

细胞移植的人嗅鞘细胞培养方法的研究

目的探讨适用于细胞移植的人嗅鞘细胞(OECs)分离与培养的方法。方法无菌条件下取自愿捐献孕5个月流产胎儿的完整嗅球进行嗅鞘细胞提取分离、纯化,并对嗅鞘细胞进行免疫组化染色及纯度检测,观察其形态学特点,检测其免疫组化染色的阳性率。结果本方法分离、培养的嗅鞘细胞大多呈三角形、梭形,有些突起较长,生长活跃,增殖迅速,P75、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色呈阳性,嗅鞘细胞阳性率为95.3%。结论该方法简便易行且不影响细胞功能,适用于细胞移植的研究。