羊布鲁菌陕西分离株OMP19基因的克隆、序列分析及原核表达

对羊布鲁菌(Brucella)陕西分离株OMP19基因进行克隆、序列分析及原核表达。利用GenBank中收录的布鲁菌(KT229642.1)OMP19基因序列,设计合成引物,应用PCR技术扩增OMP19基因,并将OMP19基因连接到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET28a-OMP19,转化到BL21感受态细胞进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法分析。结果克隆了羊布鲁菌陕西分离株OMP19全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株OMP19基因与国内外已报道的羊布鲁菌核苷酸同源性超过98%,氨基酸同源性超过98%。OMP19重组菌经诱导表达约为19ku的重组蛋白,该蛋白能与本实验室鉴定保存的阳性血清特异性结合,反应原性良好。为羊布鲁菌陕西分离株分子生物学特性研究提供资料,为进一步进行基因工程疫苗研制及ELISA试剂盒抗体检测提供了基础。

布鲁氏菌Omp19基因的生物信息学分析、克隆表达和ELISA方法的初步建立

为了进一步研究布鲁氏菌外膜蛋白19(outer membrane protein 19,OMP19)的结构与功能,并获得具有反应原性的OMP19重组蛋白,建立布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法,试验通过生物信息学软件对OMP19蛋白进行氨基酸序列分析,经PCR技术克隆Omp19基因,利用无缝克隆技术构建重组表达载体pET-32a-Omp19,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导其表达并纯化,并通过Western blotting和ELISA分析方法分别检测OMP19蛋白的反应原性,以建立基于该蛋白的间接ELISA方法。结果显示,OMP19蛋白N端有19个信号肽序列,二级结构以无规则卷曲为主,且OMP19蛋白含有优势抗原表位,利用PCR技术和无缝克隆技术成功构建了Omp19基因的原核表达载体pET-32a-Omp19,成功诱导表达并纯化了OMP19融合蛋白,大小约为35 ku,与理论值相符,并通过Western blotting和ELISA方法鉴定OMP19的反应原性,结果表明该蛋白具有较好的反应原性,且包被浓度为10μg/mL,一抗稀释比为1∶50,二抗稀释比为1∶8000时,P/N值最大,为2.80。本研究结果为布鲁氏菌病快速诊断方法的建立和新型疫苗的研发奠定了理论基础。

布鲁氏菌Omp19基因真核载体的构建及对细胞免疫的影响

目的了解羊种布鲁氏菌Omp19基因在真核细胞中的表达和对细胞免疫的影响。方法根据GenBank公布的羊布鲁氏菌16M株外膜蛋白Omp19基因序列设计1对引物,以其全基因组为模板进行扩增,Omp19基因扩增片段连接pMD18-T载体,转染及测序鉴定正确后进行双酶切,构建重组质粒pLEX-MSC-Omp19,转染巨噬细胞RAW264.7中,用Western blot分析Omp19基因在巨噬细胞内的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染Omp19基因的细胞干扰素-γ(IFN-γ)和IL-6分泌的影响。结果获得534bp目的基因片段并成功构建Omp19真核表达载体,Omp19基因在巨噬细胞内成功表达,表达蛋白Omp19可显著提高细胞分泌IFN-γ和IL-6水平(P<0.01)。结论 Omp19基因表达产物在细胞内具有免疫原性,能提高细胞免疫水平,可作为亚单位疫苗候选基因。

布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19序列克隆与原核表达

目的:研究猪型布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19的序列性质,同时,进行目的基因的原核表达。方法:以猪型布鲁氏菌基因组作为模板进行基因序列的扩增,利用大肠杆菌原核表达系统进行重组表达。结果:猪型布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19的开放阅读框序列全长为534 bp,演绎177个氨基酸。诱导表达的重组蛋白质的理论分子量为17.6 kD,而且实际大小与理论值一致。结论:成功表达了Omp19分子,为进一步研究Omp19分子的免疫保护作用奠定了基础。