奶牛流产鹦鹉热衣原体ompA基因的克隆与原核表达

目的表达奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用套式PCR方法扩增出了奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因完整片段,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组目的蛋白的表达结果。结果重组蛋白经奶牛衣原体阳性血清鉴定正确。结论ompA基因在原核表达系统中得到正确表达。

赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达

目的分析赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22的结构特征,并对其进行克隆表达。方法分别以问号状赖型钩体017株、56601株及双曲状钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建Loa22基因与质粒pGEX-4T-1的重组原核表达质粒,克隆筛选并测序。利用Bioedit、Dnaman、PSIPRED、NCBI及SignaIP等对其结构进行分析。最后在大肠杆菌JM109中诱导表达目的蛋白。结果不同毒力赖型钩体均能扩增出约600bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pGEX-Loa22构建成功:分析显示不同赖型钩体的Loa22的同源性很高,C末端都具有同OmpA一致的保守序列及肽聚糖相关基序,都有信号肽序列;表达产物经SDS-PAGE检测证明是目的蛋白。结论赖型钩体具有编码OmpA膜蛋白的Loa22基因,可能与赖型钩体毒力和免疫原性存在某种相关性。

11株禽多杀性巴氏杆菌OmpA基因克隆测序及其序列分析

为了解国内禽多杀性巴氏杆菌流行株（Pasteurellamultocida，Pm）OmpA基因的变异情况，参考Gen-Bank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计一对特异性引物，采用PCR方法对11个禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A，B，D）的OmpA基因进行扩增，将各菌株纯化回收的扩增产物与pMDl8-T载体连接，筛选阳性克隆进行测序。结果表明：14个菌株的OmpA基因开放阅读框在1047～1077bp之间，其中长度为1062bp的有9个菌株；SignalIP4．0预测表明，信号肽均为N端21个氨基酸残基，成熟蛋白氨基酸残基数量在327～332之间，推测的分子量为35．19～36．35kD。与GenBank中12个菌株OmpA基因核苷酸序列比对及遗传进化分析发现，核苷酸同源性为85．3％～100％；氨基酸同源性为83．1％～100％；其中C48—1，1010，9003，890920，921012，xj等6个国内禽Pm分离株OmpA序列同源性为100％。由此可见国内禽Pm菌株OmpA基因非常保守。

鸭疫里默氏菌OmpA与鸭IL-2融合基因的克隆与原核表达

以鸭疫里默氏菌吉林分离株JL-RA1OmpA基因(登录号HQ707077)和鸭DuIL-2成熟片段基因(登录号AY193713)为模板,分别设计带有linker的特异性引物,PCR扩增出序列大小为1182bp的OmpA-linker基因和序列大小为381bp的linkerDuIL-2成熟蛋白基因。利用SOE-PCR技术,成功构建OmpA-DuIL-2融合基因,片段大小为1551bp。将其转入大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建pET-OmpA-DuIL-2融合表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析得到分子量大小约为61 kDa的融合蛋白,经Western-blot分析该融合基因同时具OmpA和DuIL-2的反应原性。

羊流产嗜衣原体ompA基因克隆及生物信息学分析

分析羊流产嗜衣原体ompA基因结构并预测其编码蛋白的结构和功能。采用DNA Star、DNA MAN、vector NTI suite11.5序列分析软件和在线网站ExPASy分析该基因的结构和预测其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、一级结构修饰位点、二级结构特征及三维空间构象、潜在抗原表位等。结果显示,该基因全长1 170 bp,可编码389个氨基酸,编码蛋白理化性质较稳定,无各种亚细胞定位序列,含有多个能被其他酶修饰的位点,该蛋白以无规则卷曲为主,大部分氨基酸残基包埋在分子内部,含5个跨膜区,3个亲水性较强的抗原表位。ompA基因生物信息学分析结果为ompA蛋白功能的深入研究和新型多价疫苗的开发提供了基础数据。

鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的克隆与表达

根据GenBank中鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌贵州分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-ompA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,实现了鸡肠炎沙门氏菌ompA蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析结果表明,该重组蛋白的分子质量约为55 ku,可溶性分析结果表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白具备免疫原性。

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达(英文)

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体。将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达。结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达。结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究致病机制及疫苗的研究提供理论依据。

1型鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及其ompA基因B细胞表位预测

本研究从贵州发病鸭中分离到1株致病菌,经生化试验、16S rRNA序列分析、血清学试验和动物回归试验,鉴定为1型鸭疫里氏杆菌(RA),药敏试验结果表明,其对头孢拉定、头孢曲松钠、头孢噻肟和氟苯尼考高度敏感;同时根据GenBank中鸭疫里氏杆菌ompA基因序列,设计1对引物,成功克隆出鸭疫里氏杆菌ompA基因,扩增产物大小为1149 bp。采用DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对鸭疫里氏杆菌ompA基因的氨基酸序列进行了B细胞表位预测,为进一步研究鸭疫里氏杆菌表位疫苗和分子诊断技术的建立奠定基础。

斑点热群立克次体广东分离株OmpA基因片段的克隆及序列分析

目的 鉴定斑点热群立克次体广东分离株GDFK5 8- 2 0 0 0和GDFK5 9- 2 0 0 0种属类型。方法 用PCR方法扩增GDFK5 8- 2 0 0 0和GDFK5 9- 2 0 0 0的OmpA基因起始部位 5 33bp片段 ,克隆于pMD18-T载体并进行测序 ,测序结果与Genbank中其它斑点热群立克次体相应基因片段的核苷酸进行比较 ,用DNASTAR软件分析结果。结果 GDFK5 8- 2 0 0 0、GDFK5 9- 2 0 0 0和西伯利亚立克次体之间的核苷酸同源性为 99 6 %～ 99 8% ,推断的氨基酸同源性为 99 6 %～ 99 8% ,常用于分类鉴定的酶切位点完全一致。结论 两株广东分离株属于斑点热群立克次体的西伯利亚立克次体种。

奶牛衣原体ompA基因的克隆及序列分析

以流产奶牛肝组织块内提取的基因组DNA为模板,根据GenBank数据库中的衣原体ompA基因序列设计2对引物,采用套式PCR进行扩增.PCR产物经纯化后连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后,进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:ompA基因的开放阅读框架全长1 170 bp,编码由389个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为41.9 ku,等电点为7.61;SMART分析表明,ompA基因编码的氨基酸中,1-22位氨基酸为信号肽序列,另外还有7个保守的半胱氨酸残基形成二硫键;BLAST同源性分析表明,ompA基因的核苷酸序列与已发表的衣原体ompA序列的同源性均达到了98%以上.

鸭疫里氏杆菌吉林分离株16S rRNA系统分析及其OmpA基因克隆

为研究鸭疫里氏杆菌(RA)16S rRNA变异与OmpA基因之间的关系,提取了RA吉林分离株JL-RA1和JL-RA3总DNA,并设计特异性引物扩增两株RA保护性抗原OmpA全基因序列。结果显示,扩增出的16S rRNA序列大小均为1478 bp,OmpA片段序列大小均为1164 bp,与预期结果一致。扩增的16S rRNA与GenBank中已知的RA 16S rRNA序列同源性高达99.0%～99.9%,扩增的OmpA序列与GenBank中已知的RA OmpA序列同源性达93.3%～100%,编码蛋白质的氨基酸序列同源性为96%～100%。

禽多杀性巴氏杆菌ompa基因在Vero细胞中的表达

利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌1 050 bp的ompa基因片段,克隆到pUCm-T载体上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCA(pcDNA3.1-OmpA),将该重组质粒体外转染Vero细胞,检测其转录和表达情况。结果表明重组质粒pCA构建成功,通过RT-PCR由转染了重组质粒的Vero细胞中扩增出了目的条带,间接免疫荧光试验分析表明在转染了pCA的Vero细胞中出现绿色荧光,Western blotting分析显示重组质粒pCA转染的Vero细胞泳道出现约37.5 ku的特异条带,说明ompa基因在Vero细胞中成功表达了活性蛋白,从而为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。

沙眼衣原体ompA基因真核表达载体的构建及在HeLa细胞中的表达

目的 构建沙眼衣原体 (Ct)ompA基因真核表达重组质粒 ,利用脂质体体外转染HeLa细胞 ,为核酸疫苗的研制作准备。 方法 应用PCR技术从D型Ct基因组中扩增ompA全长基因 ,重组入 pUCm -T克隆载体。将pUCm -T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应 ,亚克隆入 pcDNA3 .1真核表达载体的相应位点 ,进行序列分析和酶切鉴定后 ,运用脂质体将重组体 pcDNA3 .1/ompA转染HeLa细胞 ,免疫组化法观察目的基因的表达。 结果 PCR扩增得到约 1.2kb的特异性ompA基因片段 ;序列测定证实与发布序列一致 ;构建得到真核表达重组体 ;重组质粒pcDNA3 .1/ompA在HeLa表达MOMP。 结论 CtompA基因能够在体外真核细胞中表达 ,为进一步研究CtDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。

猪流行性腹泻病毒N-E.coli OmpA融合基因构建、表达及其免疫原性评价

为获得免疫原性更强的猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白,试验将PEDV N蛋白基因和大肠杆菌(E.coli)OmpA蛋白基因进行融合,采用柔性linker联接,得到OmpA-linker-PEDV N融合基因,并克隆至pCold I质粒,构建重组质粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N。重组质粒转入BL21感受态细胞,SDS-PAGE分析重组质粒的表达,并对其编码的融合蛋白进行二级和三级结构预测。Western-blot和ELISA分析融合蛋白的免疫原性。结果表明:构建了融合基因表达质粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N,表达了约88 ku的融合蛋白;融合蛋白的二级结构未发生明显变化,三级结构预测可折叠为正确的空间构像。该融合蛋白同时具有PEDV N蛋白和OmpA蛋白的免疫原性,并且其免疫原性显著高于单一PEDV N蛋白。说明试验获得了免疫原性较好的融合基因表达蛋白,可以为PEDV N蛋白功能研究、特异性抗体制备以及PEDV亚单位疫苗的研制提供材料和研究基础。

海立啮齿杆菌OmpA基因缺失株的构建及其生物学特性

目的 探究外膜蛋白A(OmpA)基因与海立啮齿杆菌(Rh)致病性的关系。方法 采用同源重组技术构建海立啮齿杆菌分离株OmpA基因缺失株,分析其生长特性、遗传稳定性、生化特征、质谱特征、生物被膜产生能力、对小鼠肺上皮细胞(MLE-12)的黏附力,及对小鼠的致病性。结果 成功构建海立啮齿杆菌OmpA基因缺失株,可稳定遗传。与野生型菌株相比,生化特征未发生改变,质谱峰图和生长曲线基本一致,生物膜形成能力显著增强(P<0.01);对MLE-12细胞的黏附力从43.9%降低至18.3%(P<0.001);对小鼠腹腔攻毒,致死率从100%降至20%(P<0.01),基因缺失株对小鼠致病力显著下降。结论 OmpA基因的缺失致使海立啮齿杆菌的致病性明显减弱,证实OmpA在海立啮齿杆菌的感染过程中发挥着重要作用。

沙眼衣原体ompA真核表达重组体的构建及鉴定

目的 扩增D型沙眼衣原体ompA基因 ,构建真核表达重组质粒 ,为核酸疫苗的研制做准备。方法 用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段 ,重组入pUCm -T克隆载体。将pUCm -T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应 ,亚克隆入pcDNA3.1 ( + )真核表达载体 ,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选 ,酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段 ,筛选出pUCm -T/ompA ;经亚克隆 ,筛选鉴定出pcDNA3.1 ( + ) /ompA重组质粒。结论 成功地构建了pUCm -T/ompA重组质粒和pcDNA3.1 ( + ) /ompA重组质粒 ,为Ct核酸疫苗的研制提供实验基础。

多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及生物信息学分析

本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1044bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a(+)-OmpA重组菌最佳诱导条件为1mmol/LIPTG37℃诱导6h,表达的重组蛋白大小约为40ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C1684H2619N457O505S3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。

问号钩端螺旋体中一个新的OmpA家族蛋白抗原性及保守性研究

目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans)黄疸出血群赖型赖株中一个新的外膜蛋白(Omp)A家族基因LA0301,研究LA0301编码蛋白的抗原性和在15个钩端螺旋体(简称钩体)血清群代表株中的保守性,探讨其在疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测LA0301的特征。构建原核表达重组体pQE31-LA0301,经IPTG诱导后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹检测其免疫反应性和在不同血清型钩体中的保守性。酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹检测兔抗钩体全菌血清中的LA0301编码蛋白的抗体。结果生物信息学预测结果显示,LA0301具有OmpA家族的结构域。克隆表达了重组质粒pQE31-LA0301,重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体,效价为1:32000。在兔抗钩体全菌血清中检测到特异的LA0301蛋白抗体,并在15个血清群的代表株钩体中均可检测到LA0301蛋白。结论LA0301蛋白是问号钩体中一个新的OmpA家族蛋白,具有良好的抗原性和保守性,并且能在钩体感染的过程中刺激机体产生相应的抗体。为进一步研究钩体新型疫苗候选基因奠定了基础。

山羊流产衣原体ompA和CPAF基因的序列分析及原核表达

为了解山羊流产衣原体陕西分离株ompA和CPAF基因的遗传变异情况及制备检测抗原,根据GenBank收录的ompA和CPAF基因序列设计合成特异性引物,分别进行ompA基因和CPAF基因的基因克隆、序列分析及原核表达。结果表明,成功克隆出大小为1053 bp的ompA基因和大小为1056 bp的CPAF基因;核酸序列分析显示ompA和CPAF基因与已报道的山羊流产衣原体ompA和CPAF基因同源性分别为99.54%~99.91%和91%~100%;成功构建了表达ompA和CPAF基因的原核表达菌株,经IPTG诱导后分别表达38.6 ku和38.7 ku的ompA和CPAF重组蛋白,Western blot显示纯化复性的两种重组蛋白均能与山羊流产衣原体阳性血清相结合。试验结果为进一步建立山羊流产衣原体抗体ELISA检测方法奠定了基础。

鸭疫里默氏菌贵州分离株OmpA基因的克隆及生物信息学分析

为了解鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州分离株OmpA基因遗传特性和用作基因工程亚单位疫苗开发的可能性,以13株RA贵州分离株(RA-SS-1~12株和RA-AS-1株)为研究对象,用RA OmpA基因特异性引物对13株RA贵州分离株进行PCR扩增,将扩增得到的OmpA基因片段与pMD19-T载体连接,转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件将13株RA贵州分离株与国内外15株参考株OmpA基因序列进行核苷酸同源性分析和遗传进化分析,并对RA OmpA蛋白进行理化性质分析、跨膜结构和信号肽预测、B细胞抗原表位预测、二级和三级结构预测。结果表明,13株RA贵州分离株OmpA基因全长均为1164 bp,可编码387个氨基酸,株间核苷酸同源性为100%,与参考株GZ-RA8、GZ-RA9、GZ060302、SD-RA2018和Yb2株的同源性达100%”;RA OmpA蛋白属亲水性蛋白,无跨膜和信号肽区域,含有较多的优势抗原表位结构,且OmpA基因高度保守并具有良好的抗原特性,其可作为制备RA基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。