西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析

本研究旨在分析一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH基因的遗传进化、分子特征和抗原性。从一株西藏牦牛源B型多杀性巴氏杆菌的全基因组测序中获得OmpH基因序列,对其核苷酸序列进行遗传进化分析,通过生物信息学软件在线对OmpH基因编码的氨基酸序列进行理论分子质量、理论等电点、亲水性和疏水性、跨膜结构、结构域、二、三级结构及抗原性分析。结果表明OmpH基因全长1002 bp,编码333个氨基酸;遗传进化分析发现,西藏牦牛源Pm的OmpH基因与新疆牦牛源的同源性最近。OmpH蛋白的分子特性分析发现该蛋白为亲水性蛋白,较为稳定,具有信号肽结构,所有序列均在膜外,无跨膜结构,属于分泌型蛋白,在PFAM数据库中存在Porin_1结构域及低复杂性区域;该蛋白的二、三级蛋白结构分析发现分子同源三聚体构成,其中无规则卷曲占比45.35%,结构较为稳定。抗原性分析OmpH蛋白的保护性抗原的总体预测为0.6945,高出正常阈值0.2945。OmpH具有抗原性的可能性较大,可作为免疫原性蛋白和多杀性巴氏杆菌疫苗的较佳候选抗原。

猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆、表达

利用已分离的菌株030224HB,根据NCBI上的序列(U52208)设计了一对引物,用PCR方法扩增了猪源多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白基因(ompH),扩增的片段大小为1114bp(ORF为960bp),并克隆到载体pMD18T(TVector),测序表明该基因相当保守。用pET28b构建了原核表达载体pET28bompH,转化BL21并诱导表达,SDSPAGE结果显示表达蛋白约为35ku,与报道大小相近。Westernblot结果表明表达的蛋白质具有生物学活性,然后用所表达的蛋白做了ELISA检测方法的初步探讨。

普通PCR与降落PCR扩增OMPH基因的比较

为了研究牦牛源多杀性巴氏杆菌（C47—8）OMPH基因，试验采用试剂盒法提取菌株基因组DNA，比较了降落PCR与普通PCR扩增OMPH基因片段的特点。结果表明：扩增出的特异性条带与目的基因片段长度一致，普通PCR法未扩增到OMPH基因片段，降落PCR法扩增出特异性高的OMPH基因片段；在相同的反应体系中，降落PCR程序能明显提高PCR的特异性，它可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段，或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。

牦牛源多杀性巴氏杆菌血清型鉴定及ompH基因序列分析

为分析牦牛多杀性巴氏杆菌(P.multocida)分离株与疫苗株的血清型和ompH基因差异,本研究利用PCR方法鉴定其血清型,并克隆、测序ompH全长基因,用DNAMAN、DNAStar对其进行生物信息学分析。结果显示,分离株与疫苗株血清型为B型,标准株血清型为E型。分离株和疫苗株ompH基因编码氨基酸有2个缺失和2个突变,同源性为99.4%。研究表明ompH基因具有很高的同源性,但氨基酸的缺失和突变可能使抗原表位发生变化,也是导致免疫失败的原因之一。

牦牛源多杀性巴氏杆菌ompH基因原核表达及抗原性鉴定

【目的】克隆、表达牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(ompH)并鉴定其抗原性。【方法】扩增牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的ompH基因,构建原核表达载体pET28a-ompH,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达目的蛋白,利用Western blot检测该蛋白的抗原性。【结果】成功克隆、构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的pET28a-ompH原核表达载体。诱导表达蛋白约38 kDa,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原性。【结论】ompH基因的成功表达为重组OmpH蛋白的血清学检测方法的建立、多克隆抗体的制备及疫苗的研制奠定了基础。

禽源多杀性巴氏杆菌ompH基因序列分析

根据NCBI登录的序列(PMU50907)合成1对引物,用PCR方法扩增了郎德鹅多杀性巴氏杆菌ompH基因,预计扩增片段大小为1544 bp(ORF 1062 bp),但是分离菌实际测序片段大小为1537 bp(ORF 1056 bp)。结果分离株与参考株外膜蛋白的ORF存在6个碱基的缺失,蛋白质序列有变化。

青藏高原禽源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.multocida)外膜蛋白H(ompH)基因的核苷酸序列,设计合成了一对特异性引物ompH3,用PCR方法扩增了1株禽源多杀性巴氏杆菌野生菌株(P1004)的ompH基因。然后将获得的928bp的目的基因片段连接到pMD18-T载体上,进行多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆及序列分析。结果表明,P1004和标准菌株C47-8的ompH基因编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为62%和91.7%,与已知的9个国内外代表株进行比对分析,核苷酸序列的同源性在55.9%～65.2%之间,氨基酸序列的同源性在91.3%～91.7%之间,说明P1004的ompH基因序列与C47-8以及国内外代表株之间有明显差异,即变异明显,揭示了禽源多杀性巴氏杆菌的ompH基因与其他菌株的分子进化关系,为ompH基因应用于疫苗的可行性奠定了基础。

溶藻弧菌HY9901外膜蛋白OmpH的基因克隆及其生物信息学分析

根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株外膜蛋白OmpH的全长基因。结果显示,该基因(GenBank登录号:JX855924)全长573 bp,共编码190个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子量约为21.1 kD,等电点为9.02。SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SofiBerry-Psite预测结果显示,OmpH不存在信号肽与跨膜区,含有1个N-糖基化位点,6个磷酸化位点,1个内质网靶信号位点以及3个微体C末端靶信号位点。利用MAGE5.0软件,以邻位相连法构建OmpH系统进化树,结果显示,溶藻弧菌OmpH与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)等有较近亲缘关系。采用多种参数成功预测了OmpH可能的B细胞抗原优势表位,分别是第5-10、106-110、120-125、158-163和175-180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟了OmpH亚基三维结构模型,且与其同源蛋白大肠杆菌(Escherichia coli)Skp蛋白有相似构型。

禽多杀性巴氏杆菌C48-3株ompH基因敲除突变株的构建及其生物学功能

【目的】探讨ompH基因在禽多杀性巴氏杆菌致病过程中的作用。【方法】利用同源重组原理构建中间为四环素抗性基因,两侧为ompH基因上下游同源序列同源的敲除载体pWSK29ΔompH,将敲除载体电击转入C48-3株感受态细胞中,通过四环素抗性和菌落PCR筛选ompH基因的敲除突变株,并通过组合PCR、逆转录PCR和DNA测序对突变株进行验证。用生物学功能实验比较野生株、互补株和突变株在生长速率、荚膜结构、粘着能力和致病性等方面的差异。【结果】组合PCR、逆转录PCR和DNA测序结果证实ompH基因的敲除突变株C48-3ΔompH构建成功,电镜观察结果证实ompH基因的缺陷影响细菌的荚膜合成能力,粘附实验结果显示与野生株C48-3和互补株C48-3C相比突变株C48-3ΔompH对CEF细胞的粘附能力显著降低(P<0.01),而小鼠毒力实验结果表明突变株C48-3ΔompH的致病性相对减弱。【结论】本实验构建的突变株C48-3ΔompH,为进一步研究多杀性巴氏杆菌的致病机理奠定基础。

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OMPH1基因的克隆及原核表达

本试验旨在克隆和表达兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OMPH1基因,并对其表达产物的反应原性进行研究。以兔多杀性巴氏杆菌C51-2-499株总DNA为模板,进行外膜蛋白基因OMPH1的PCR扩增,得到了1条大小为1 041 bp的基因片段,克隆至pMD-18T中。测序分析证明,它与国内外报道的多杀性巴氏杆菌OMPH1基因的核苷酸序列相似性达99%以上。将该基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,经酶切和测序分析表明,重组表达载体pET-30a(+)-OMPH1构建成功。将此重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。SDS-PAGE检测结果证实,该基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式得到表达,表达产物的分子质量约47KD,与预期的结果一致。Western-blot分析表明,OMPH1重组表达蛋白具有反应原性,可被兔多杀性巴士杆菌阳性血清识别,为兔多杀性巴氏杆菌基因重组疫苗及新型诊断试剂的研究奠定了基础。

猪源多杀性巴氏杆菌荚膜分型及外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内猪源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况及与荚膜型之间的相关性,本试验采用PCR方法对44株猪源多杀性巴氏杆菌进行荚膜分型和ompH基因的扩增测序。结果显示,44株菌株中22株为荚膜A型,17株为荚膜B型,5株为荚膜D型;44株菌株的ompH基因开放阅读框在1 002~1 056bp之间;SignaIP 4.1预测结果显示,信号肽为N端20个氨基酸残基;ProtParam分析结果显示,成熟蛋白氨基酸残基数量在313~331aa之间,推测的分子质量在33.83~36.46ku之间。序列分析结果显示,44株菌株核苷酸同源性为86.2%~100.0%,氨基酸同源性为86.0%~100.0%;ompH基因核苷酸序列遗传进化树结果显示,荚膜A型、B型和D型菌株分别在不同的分支。试验结果表明,猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因在不同血清型之间具有较高的同源性,与荚膜型之间存在相关性。

8株禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内禽多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）流行株外膜蛋白 H（OmpH）基因的变异情况，参考GenBank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计1对特异性引物，采用PCR方法对不同来源的8株禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A、B、D）的OmpH基因进行扩增、测序。结果显示，11个菌株的OmpH基因开放阅读框在1002-1071 bp 之间；SignalIP 4.0预测结果表明，信号肽均为N端20个氨基酸残基，成熟蛋白氨基酸残基数量在314-337 aa之间，推测的分子质量在33.76-37.04 ku之间。与GenBank中15个菌株OmpH基因序列比对结果发现，核苷酸同源性在84.9%-100.0%之间；氨基酸同源性在81.5%-100.0%之间；其中C48-1、1010、9003、890920、921012、XJ-e 6个国内禽Pm分离株OmpH序列同源性为100.0%。试验结果表明，国内禽Pm菌株OmpH基因非常保守。

不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况,采用PCR方法对16株不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌的ompH基因进行扩增测序和分析。结果显示:16株菌株的ompH基因开放阅读框在1002~1056 bp之间;信号肽为N端20个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在313~331 aa之间,氨基酸同源性为82.1%~100%;基于Omp H氨基酸序列的系统发育树中鸡源菌株(荚膜A型)、猪源和牛源菌株(荚膜B型)分别在不同的分支。序列分析结果表明,ompH基因序列差异与荚膜型之间存在相关性,而与毒力大小无相关性。

3株不同毒力巴氏杆菌外膜蛋白H基因克隆及序列分析

参照GenBank中巴氏杆菌外膜蛋白H（ompH）基因核苷酸序列，设计了一对特异性引物，通过PCR方法，扩增了3株不同毒力猪源巴氏杆菌CA4—1株、679—230株、3397A株ompH全基因。PCR产物克隆至pMD-18T载体，进行序列分析，发现3个菌株ompH基因完整的ORF大小分别为1008bp、1008bp和1047bp，分别编码336、336、349个氨基酸，它们的前20个氨基酸均组成信号肽。与已知的15个Heddleston血清型的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较，核苷酸同源性在83．3％-99．8％，氨基酸同源性在79．2％-99．4％。序列分析结果表明，ompH基因在不同血清型之间具有较高的同源性。

禽多杀性巴氏杆菌X-73株omp H基因的克隆和表达

以禽多杀性巴氏杆菌国际标准株X-73基因组DNA为模板,采用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟外膜蛋白H的ompH基因,将ompH基因克隆至pMAL-p2X表达载体中,构建重组表达质粒pMAL-p2X-ompH,转化大肠杆菌BL21,用SDS-PAGE电泳检测IPTG诱导后的表达蛋白.DNA测序结果表明ompH基因片段大小为1 002 bp,与已报道的ompH基因的核苷酸序列完全相同、而SDS-PAGE结果显示表达分子质量约为78 ku,与预期的融合蛋白MBP-OmpH分子质量相符,表明成功构建出原核表达质粒并实现了目的蛋白表达,为进一步开展禽多杀性巴氏杆菌保护抗原的研究奠定基础.

多杀性巴氏杆菌分离鉴定及序列分析

旨在了解新疆地区多杀性巴氏杆菌主要流行株的特性。通过病原的分离纯化、PCR扩增及测序,分析8株多杀性巴氏杆菌的血清型,16SrDNA基因、ompH基因和ompA基因的差异。结果表明,3株羊源、2株牛源和1株禽源分离株为荚膜A型,1株牦牛源分离株为荚膜B型,1株标准株为荚膜E型,均具有很强的致病性。分离株与GenBank公布的代表株的16SrDNA基因、ompH及ompA基因同源性分别为93%～100%、93%～100%、98%～100%。ompH基因的ORF氨基酸C端最后10个氨基酸变化较大,分离到5株ompA基因的ORF氨基酸序列N端多出6个氨基酸(M-K-R-I-I-Q)替代原先的起始位置。可见:新疆主要流行株为强致病性的荚膜A型,且有出现变异趋势。

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因的克隆与原核表达

为克隆和表达兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因,并对其表达产物的反应原性进行研究,用设计的1对特异性引物对兔多杀性巴氏杆菌CVCC500株总DNA进行ompH2基因的PCR扩增。将PCR片段克隆至pMD18-T载体中,进行测序。随后,将该基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,将重组表达质粒pET30a(+)-ompH2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。测序分析证明,得到了1条大小为1 052bp的基因片段,与国内外报道的兔多杀性巴氏杆菌ompH2基因的核苷酸序列相似性达99%以上。重组表达质粒的酶切鉴定、PCR扩增和测序分析表明,重组表达载体构建成功。SDS-PAGE检测结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约47ku的融合蛋白。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白ompH2具有反应原性。为研究兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2的免疫学活性奠定了基础。

牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH和OmpA重组亚单位疫苗对小鼠的免疫效果

为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)外膜蛋白H(OmpH)和外膜蛋白A(Om-pA)的免疫效果,构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH和OmpA的原核表达载体pET-28a-OmpH和pET-28a-OmpA,表达并纯化重组外膜蛋白H(rOmpH)和重组外膜蛋白A(rOmpA),制备相应的单价疫苗和二价疫苗(rOmpH-A)以及全菌灭活疫苗,以PBS作为对照,皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA检测抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离菌株进行攻毒,比较保护力。结果,各试验组均能产生特异性抗体,全菌灭活组和rOmpA组小鼠的存活率分别为80%、40%,而rOmpH组、rOmpH-A组小鼠全部死亡,rOmpH和rOmpH-A组仅推迟小鼠死亡的时间,说明保护力微弱,不能抵抗同源菌株的致死性攻击。结果表明,rOmpA蛋白具有保护力,而rOmpH不具有保护力。

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因在真核细胞中的表达及检测

利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌1 050 bp的外膜蛋白H基因(omph)片段,克隆到pMD18-T上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pOMPH,将该重组质粒体外转染SP2/0细胞,检测其表达情况。结果表明本试验成功构建了真核表达质粒pOMPH,通过RT-PCR由转染了重组质粒的SP2/0细胞中扩增出了目的条带,Western blotting分析结果显示重组质粒pOMPH转染的SP2/0细胞泳道出现38ku的特异条带,间接免疫荧光分析表明在转染了pOMPH的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明omph基因在SP2/0细胞中成功表达了活性蛋白,从而为进一步研制DNA疫苗奠定了基础。