应用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓唾液差异蛋白

目的:应用双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)和质谱技术筛选、鉴定与口腔扁平苔藓(OLP)患者唾液有关的差异蛋白。方法:收集3例OLP患者及3例健康人唾液,提取唾液总蛋白采用2-D DIGE技术分离蛋白质,寻找差异蛋白质点应用液相色谱一质谱联用技术(LC-MS)对差异蛋白质点进行质谱鉴定。结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示各样品条带清晰,无明显蛋白质丢失,经2-D DIGE分离蛋白质后,蛋白质点重复性较好。OLP患者组和健康对照组唾液差异蛋白质点数平均为(317±71)个,用质谱技术鉴定了重复性较好的4个差异蛋白质点(分泌型IgAl、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白)在OLP患者唾液中表达量均上调。结论:分泌型IgAl、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白在OLP患者唾液中高表达可能参与了OLP的发生、发展。

凝胶过滤/离子交换全二维液相色谱系统的构建与评价

基于蛋白质的尺寸及带电性质,将凝胶过滤色谱(GFC)与离子交换色谱(IEC)两种分离模式结合,采用双捕集柱接口构建了GFC/2×IEC二维液相色谱(2-D LC)分离系统,同时考虑离子交换色谱分离蛋白质对等电点范围的限制,进一步结合中心切割平行柱的方法实现对蛋白质的全二维分离。为与后续蛋白质在线酶解、多肽分离及质谱鉴定匹配,系统中采用常规柱以保证蛋白质质谱鉴定对样品量的要求,3种常规分离柱分别选用凝胶过滤色谱柱TSK-GEL G3000SW_(XL)(300 mm×7.8 mm,5μm)、强阴离子交换色谱柱Hypersil SAX(100 mm×4.6 mm,10μm)和强阳离子交换色谱柱Hypersil SCX(100 mm×4.6 mm,10μm)。最终以酵母细胞蛋白质提取液为样品,对构建的二维系统加以评价,在总蛋白质浓度13.5 mg/mL、上样体积100μL的条件下,将第一维分离等时间切割17次,并将切割馏分全部导入第二维继续分离,二维系统在148 min内获得的总峰容量达到884。说明所构建的系统可以用于蛋白质的在线全二维分离。

基于超高效液相色谱-八端口转子阀的微升级预分级系统的建立

复杂生物系统蛋白质组的深度覆盖鉴定得益于近年来快速发展的高效色谱分离和串联质谱分析技术。二维高效液相色谱(2-D HPLC)是实现复杂肽混合物正交分离的有效手段,但其缺点是运行时间长,通常要求肽上样量在毫克级别,且收集时的组分体积大,后续合并流程复杂,而有望替代其的StageTip技术,则由于有限的色谱分离梯度,难以达到充分的正交分离。该文探索了超高效液相色谱(UPLC)和八端口转子阀联用,作为高效、便捷肽段预分离和收集系统的可行性。研究结果显示,将UPLC的高pH反相色谱分馏与在线LC-MS/MS相结合,可以实现高pH和低pH条件下基于肽段不同色谱保留行为的正交互补分离,在蛋白质鉴定方面表现出优越的性能。应用该方法对人肝癌细胞系HepG2进行3次技术重复试验,重复试验间具有非常高的定量重现性(决定系数R^2>0.95)。与传统StageTip方法相比,肽段鉴定数提高了23.52%。该分级方法灵活、稳定,能够针对较少的样品开展蛋白质组深度覆盖分析。

瓣膜性心脏病伴慢性心房颤动患者心房组织呼吸链相关蛋白质定量蛋白质组学分析

目的 从蛋白质组学角度分析心房颤动（房颤）患者心房能量代谢状态,揭示房颤的发生基质.方法 2011年1月至8月于中南大学湘雅二医院获取患二尖瓣疾病需行外科换瓣手术的窦性心律患者（n=6）和房颤患者（n=8）左心耳组织.分离蛋白质,行同重元素标记的相对和绝对定量（iTRAQ）标记及质谱分析,通过分析软件行蛋白质鉴定和定量分析,运用蛋白印迹法分析确定结果准确性.结果 发现1 023个蛋白质,517个差异表达蛋白质,122个能量代谢相关,46个参与呼吸链过程.下调蛋白质在慢性房颤患者左心耳组织的能量代谢中占据主导优势.蛋白印迹分析证实了结果的可靠性.结论 瓣膜性心脏病患者慢性房颤过程心房肌细胞产能状态受损.