基于响应面法优化双酶同步酶解的全豌豆乳的稳定性及营养特性研究

豌豆作为一种大宗豆类,具有营养价值高及低致敏性等特点,但全豌豆乳体系易絮凝失稳,限制其在食品中的应用。本文以脱皮豌豆为原料,采用高压均质耦合生物酶解(中温α-淀粉酶和纤维素酶)处理,通过离心沉淀率等指标,以及Box-Behnken设计优化酶解工艺条件,揭示最优工艺下全豌豆乳的稳定性和营养特性变化规律。结果表明,相较于传统过滤、单一酶解、双酶分步酶解等方法,中温α-淀粉酶和纤维素酶双酶同步酶解制备的全豌豆乳稳定性更优,最佳的酶解工艺参数为:中温α-淀粉酶:纤维素酶为4.5:5.5(酶活力比,U/g淀粉),添加总量为12 U/g,酶解时间为65 min,该条件下制得的全豌豆乳的离心沉淀率最低(27.70%),在不经过滤和不添加稳定剂的情况下,贮藏60 d内无明显的沉淀分层。与传统单体营养素复配工艺得到的豌豆乳相比,该优化工艺下制得的全豌豆乳稳定性显著提高,淀粉的消化程度降低了12.74%,蛋白质的消化程度提高了16.41%。研究结果为浓浆类的植物乳开发提供一定的理论指导。

秦川牛成纤维细胞的分离培养体系优化

为建立秦川牛体细胞分离培养体系,分别选用组织块培养法、胰酶-胶原酶消化法和胶原酶-胰酶消化法提取秦川牛耳缘成纤维细胞。结果表明:组织块培养法获取成纤维细胞所需周期长,组织块贴壁17 d后可获得原代成纤维细胞,而双酶消化法在原代细胞贴壁至9 d时便可进行传代纯化培养;与双酶消化法Ⅱ相比,双酶消化法I获得的原代成纤维细胞浓度1.24×10^(6)/mL显著高于双酶消化法Ⅱ(0.9×10^(6)/mL)(P<0.05);传代培养5 d后,细胞汇合度达到80%,取第三代成纤维细胞进行免疫荧光和流式细胞术鉴定,成纤维细胞纯度达到95%以上;纯化后的成纤维细胞培养至第3天,开始进入对数生长期,第8天时增殖速度下降进入平台期。因此,双酶消化法I(0.25%胰酶处理30 min,再用1%胶原酶处理60 min)为分离培养秦川牛耳缘成纤维细胞的最佳方法。

改良酶消化法体外培养、纯化分离人颞下颌关节滑膜A型细胞

目的探讨获取人颞下颌关节滑膜A型细胞的较佳方法,为A型细胞的进一步研究奠定基础。方法分别用组织块法、传统酶消化法与改良的酶消化法培养滑膜细胞,观察培养3 d、7 d、2周、4周时细胞生长情况,记录首次传代时间。通过免疫组化检测衬里层细胞CD68、组织蛋白酶S的表达来检测A型细胞吞噬功能。结果滑膜组织块法接种约7 d后部分组织块周围有细胞游离出来,约4周后滑膜细胞长势接近80%融合密度,可进行首次细胞传代。传统酶消化法细胞贴壁缓慢,4周时才能观察部分细胞团形成,向周围呈放射状生长,约6周后才可首次传代。改良酶消化法接种3 d后,光镜下观察部分单个细胞贴壁,有一些胶原酶未消化完全而又能经过研磨透过滤网的微小组织块或细胞团块,在贴壁后迅速向周围增殖,约2周后可首次传代,3周后再次传代的细胞量与组织块法4周后首次细胞传代时间相同。免疫组化检测CD68有阳性表达,细胞位于靠近关节腔侧,组织蛋白酶S未见阳性表达。结论改良的酶消化法培养对比组织块法、传统酶消化法,在获得相同细胞量的基础上,缩短了原代细胞培养时间。改良酶消化法传代时A型细胞尚在存活期间,给后期A型细胞纯化分离奠定了基础。巨噬细胞标志物Cathepsin S在A型细胞上无表达,提示A型细胞由于体内局部环境的作用,已有别于巨噬细胞。

玉竹多糖对人脐带间质干细胞培养的影响研究

目的:探究培养液中添加玉竹多糖对人脐带间质干细胞(hUC-MSCs)培养的影响。方法:比较在培养液中添加玉竹多糖和传统培养方法得到的人脐带间质干细胞,在形态、稳定性、产量、细胞分化等指标上的区别。结果:测得传统酶消化法P0代细胞每瓶(T75)收获细胞总量为4.53×10^(6)cells、活率95.5%,而添加玉竹多糖的酶消化法收获细胞总量为5.35×10^(7)cells、活率97.9%;定向诱导分化两种方法得到的hUC-MSCs,无明显差异。结论:与传统酶消化法相比,添加玉竹多糖的酶消化法可以提高细胞产量、缩短生产时间,利于细胞的大规模化生产,且细胞分化无明显差异,能满足生产和临床需求。

离体法在饲料复合酶配方筛选中的应用

通过模拟动物消化生理规律 ,采用胃蛋白酶盐酸溶液 ( PPS)和猪小肠液 ( PIF)两步处理为特点的离体法分别测定 9种鸡复合酶饲料和 9种猪复合酶饲料的能量消化率 ,从而筛选出最佳复合酶组合。结果表明 ,最佳鸡饲料复合酶组合为纤维素酶 1号 +植酸酶 2号 +蛋白酶 3号 +淀粉酶 2号 ,最佳猪饲料复合酶组合为纤维素酶 3号 +植酸酶 3号 +蛋白酶 3号 +淀粉酶 3号。肉鸡饲养试验结果表明 ,最佳复合酶试验组较对照组平均日增重提高 9.60 % ,料肉比降低 2 6.10 % ;仔猪饲养试验结果表明 ,最佳复合酶试验组较对照组平均日增重提高 12 .4 7% ,料肉比降低3.2 1%。

改进的酶消化法培养新生大鼠Müller细胞

目的通过改进的酶消化法,简化Muller细胞的培养和纯化过程。方法采用将眼球培养前处理和机械吹打、贴壁后反复胰蛋白酶消化的方法培养新生大鼠Muller细胞,进行免疫组织化学染色和光电镜观察。结果培养的Muller细胞光镜下胞体较大,胞浆丰富,电镜下细胞器丰富,可见糖原和直径为10nm的微丝,免疫组织化学示95%以上细胞谷氨酰胺合成酶阳性,神经胶质纤维酸性蛋白阴性。结论改进的酶消化法是一种简单可行的Muller细胞培养方法。

基于PCR-RFLP的西洋参和人参指纹特征鉴定

目的建立西洋参与人参限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)的鉴定方法.方法采用改良的CTAB法从西洋参和人参中提取基因组DNA.应用生物信息学软件设计西洋参与人参核糖体DNA ITS序列的特异性引物,利用PCR技术对指定序列进行扩增,并通过RFLP方法酶切后进行指纹图谱的鉴别比较.结果提取西洋参与人参基因组DNA19 kb,并扩增核糖体122 bp大小的基因片段,经酶切后西洋参为80 bp和42 bp长度的两条片段,而人参仍然为122 bp长度的单一片段.结论西洋参与人参DNA具有特异性酶切位点,可作为西洋参与人参鉴定的有效方法,该方法简便快速,结果可靠.

中华鳑鲏皮肤细胞的分离及其细胞系的建立

采用对传统酶消化法稍进行改进建立了中华鳑鲏皮肤细胞的分离方法,获得RSDCs株(系)以便用于后续关于中华鳑鲏体色细胞研究。结果显示,对中华鳑鲏抑菌暂养8~24 h后,0.25%胰酶—EDTA消化处理3~5 min,用手术刀片顺鳞片方向刮除鳞片,在体式显微镜下解剖获得鱼类皮肤,采用IV型胶原酶—胰酶联合消化皮肤获得单细胞;获得的RSDCs于28°C,5%CO_2条件下进行培养,采用血球计数板计数法测定绘制了RSDCs生长曲线;采用RT-PCR的方法检测RSDCs F_0、F_5和F_(10)上皮标记物(Keratin 18和Vinculin A)和内皮标记物(Collagen I)的表达情况。成功分离获得RSDCs细胞株(系);RSDCs以1×10~4个/cm^2接种,倍增时间为30 h左右,呈典型的"S"型,与贴壁细胞的体外增殖行为一致;RT-PCR结果显示,随着传代次数的增加上皮标记物表达呈现下降趋势,而内皮标记物表达呈上升趋势。研究表明,改良的酶消化法能够成功分离获得RSDCs株(系);获得RSDCs体外培养生长曲线呈典型的"S"型,与贴壁细胞的体外增殖行为一致;分离获得RSDCs由上皮细胞和内皮细胞构成,但随着传代次数的增加,上皮细胞所占的比重越来越小。

脊髓性肌萎缩症的快速基因诊断研究

目的研究我国近端型脊髓性肌萎缩症（ＳＭＡ）患者的运动神经元生存基因（ＳＭＮ）外显子的缺失情况，探讨其快速基因诊断的可行性和临床应用价值。方法应用ＰＣＲ－酶切法检测２６例确诊的ＳＭＡ患者及２０名正常对照ＳＭＮ基因的第７、８号外显子的缺失情况。结果在２６例及２５例患者中，分别发现缺失了端粒ＳＭＮ基因（ＳＭＮ１）的第７和８号外显子，缺失率达１００％（２６／２６）和９６％（２５／２６），而正常对照及患者的家系成员均未发现外显子缺失。结论应用ＰＣＲ－酶切法检测ＳＭＮ１基因缺失从而进行ＳＭＡ患者的基因诊断，具有准确、简便和快速的优点。

乳鼠皮层神经元原代培养与观察

目的:通过原代培养乳鼠皮层神经元,为脑血管疾病的研究提供实验模型。方法:酶消化法原代培养出生1天Wistar乳鼠的皮层神经元,利用免疫细胞化学和免疫荧光方法进行鉴定。结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长。免疫细胞化学染色显示神经元特异性烯醇化酶阳性细胞达85%,免疫荧光显示胶质细胞酸性蛋白阳性细胞达15%。结论:酶消化法原代培养乳鼠皮层神经元是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。

大鼠腹膜间皮细胞的培养与鉴定

目的建立大鼠腹膜间皮细胞的体外培养方法。方法用0.25%胰酶-0.016%EDTA消化大鼠腹膜组织,用免疫组化鉴定细胞。结果免疫组化细胞角蛋白和波形蛋白染色均为阳性,2种染色胞浆均呈棕色;第Ⅷ因子相关抗原及白细胞CD45抗原染色均为阴性。确定了所培养的细胞为RPMCs。结论大鼠腹膜间皮细胞培养成功,该方法可为进一步研究腹腔粘连的防治提供实验基础。

一种快速、经济、省时的施万细胞体外培养和纯化方法

目的探讨一种快速、简单、经济的施万细胞(SCs)培养和纯化方法,为SCs体内移植研究提供稳定及可靠的细胞来源。方法选用SD乳鼠,取坐骨神经和臂丛神经,用单细胞双酶消化法和半植块单酶消化法培养SCs。结果用同样多的组织材料,半植块单酶消化法所获得的SCs比单细胞双酶消化法所获细胞至少多两倍,省时40min。免疫组织化学染色显示,获得的施万细胞96%以上呈S-100阳性。结论用半植块单酶消化法培养SCs,可以在短时间内获得足够数量和足够纯度的SCs。

两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较

目的:作为理想的种子细胞,成纤维细胞的高效获取及纯化尤为重要。本研究通过比较改良组织块培养法(improved tissue culture method,ITCM)及酶消化培养法(enzyme digestion method,EDM)分离培养人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF),以探讨两种方法的优缺点。方法:ITCM是将剪碎的皮肤组织置0.1%Ⅱ型胶原酶中于4℃下消化过夜,分离表皮与真皮,对真皮组织采用0.25%胰酶于室温下再次消化15 min,待组织块贴壁于培养皿后进行培养。EDM是将剪碎的皮肤组织置0.25%胰酶中于4℃下消化过夜,分离表皮与真皮,将真皮组织再次于4℃下用0.1%Ⅱ型胶原酶消化过夜,然后将组织块与酶的混合物一起过滤、挤压,用含有胎牛血清的培养基冲洗滤网,对得到的细胞悬液进行培养。ITCM与EDM均采用两种酶进行消化,但两种酶的使用顺序、消化时间及温度不同,最终接种于培养皿中进行后续培养的分别是组织块和细胞悬液。本研究利用ITCM和EDM分离、培养HFF,观察ITCM组和EDM组HFF的原代至第3代(Passage 0~Passage 3,P0~P3)的细胞形态;染色波形蛋白、CD68和角蛋白以鉴定细胞纯度;绘制P3生长曲线对比两组细胞的增殖能力。采取120 mJ/cm^(2)的中波紫外线(medium-wave ultraviolet,UVB)照射P3 ITCM组和EDM组HFF,建立光损伤模型。根据有无照射紫外线,实验分为UVB组和未照射对照组(Control)。采取二次离心法提取贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP),用含不同浓度(0,2.5%,5.0%及10.0%)PPP的完全培养基对ITCM组和EDM组的HFF进行分组培养,加入PPP 24 h后用CCK-8试剂盒检测损伤细胞的增殖情况。结果:ITCM组培养至第3天时可观察到大量HFF,受杂质影响小;EDM组HFF形态的观察受到较多杂质影响;第9天时,两组细胞均可传代;两种方法体外分离培养的HFF均呈长梭形、旋涡状生长。HFF培养至P2时ITCM组和EDM组波形蛋白的阳性率比较差异有统计学意义[(97.36±0.76)%vs(99.4±0.56)%,P<0.01],CD68的阳性率比较差异有统计学意义[(70.8±0.46)%vs(78.37±0.75)%,P<0.01],pan-keratin的表达分别为阳性和阴性。HFF培养至P3时ITCM组与EDM组比较,波形蛋白和角蛋白染色结果差异无统计学意义(均P>0.05),CD68的阳性率比较差异有统计学意义[(74.73±1.37)%vs(85.27±2.63)%,P<0.001]。EDM组P3 HFF的增殖能力显著高于ITCM组(P<0.05)。经UVB(120 mJ/cm^(2))照射后,两种方法获取的HFF出现光损伤改变;2.5%PPP组修复损伤细胞的能力显著高于其余浓度组(P<0.05或P<0.001)。结论:与ITCM法比较,EDM法获得的HFF具有纯化速度快、增殖能力强的优点;PPP对HFF的紫外线损伤具有修复作用。实验结果可为后续临床治疗研究提供理论依据。

驴皮成纤维细胞的体外培养研究

试验旨在比较不同培养方法对驴皮成纤维细胞培养的效果,以便建立其体外高效快速的培养体系。采集6~7岁健康的新疆驴真皮组织,分别用组织块贴壁法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养,并检测分析细胞的生长特点、生长速度、细胞周期与支原体污染等指标。结果显示,双酶消化法(0.25%胰酶处理1h,再用0.5%胶原蛋白酶Ⅰ处理6h)培养驴皮组织3d后,成纤维细胞进入了对数增殖期,而组织块贴壁法则需要15d;细胞周期经流式分析发现,处于G0/G1期与S+G2+M期的细胞均约为50%,其余5.17%细胞处于凋亡期,表明大多细胞处于分裂增殖的活跃期,细胞具有很强的活力;试验中培养的细胞均无支原体污染。综上,应用双酶消化法可快速、高效地建立驴皮成纤维细胞体外培养体系。

酶消化法联合组织块法与经典酶消化法体外分离培养黑色素细胞的比较

目的对酶消化法联合组织块法(以下简称"联合法")与单纯酶消化法体外分离培养人黑色素细胞进行比较,以找到更加快速、经济、简便的黑色素细胞体外分离培养方法。方法使用倒置相差显微镜连续多代观察两种方法体外培养的黑色素细胞原代、传代情况,分别从形态学、生长情况等方面对比两种方法培养黑色素细胞的差别。结果细胞形态:联合法分离的细胞同源性好,细胞较细长,树突较多且相互交叉成网状呈集落分布,但初代培养时间较长;酶消化法分离的细胞同源性一般,初代细胞较粗短,树突较少且细胞分布较分散,但初代培养时间短。两种方法细胞形态随着传代次数的增多渐趋一致。生长情况:酶消化法分离的细胞一次可获得较大的细胞量,但容易污染,且初代培养的细胞混有较多的上皮细胞,需多次传代纯化;联合法分离的细胞较单一,但细胞量相对较少,两种方法分离细胞增殖和生长曲线大体一致。结论联合法可获得比较可观的细胞量,两次传代后即可获得比较纯净的黑色素细胞,可避免胰蛋白酶对黑色素细胞的损伤,是较为快速、经济的黑色素细胞体外分离方法。

新生大鼠施万细胞体外培养的实验研究

目的通过比较两种不同的新生大鼠施万细胞(SCs)原代培养的方法 (双酶消化法与单酶消化法),探索出一种细胞纯度更高、获取时间更短的SCs细胞培养方法。方法取4~5 d SD乳鼠双侧坐骨神经,分别采用单酶和双酶消化法,联合运用半植块法、差速消化法、差速贴壁法以及抗有丝分裂法原代培养纯化SCs。培养SCs 48 h和6 d后倒置显微镜观察两组细胞形态,7 d后分别进行SCs消化与传代,细胞计数板计数两组的SCs总数,传代48 h后用免疫荧光标记S-100蛋白对两组细胞进行鉴定,CCK-8测定细胞生长曲线。结果用等量的神经组织,与单酶消化法比较,双酶消化法培养的SCs所获得SCs数目远高于单酶消化法所获得细胞数目(2倍以上)。免疫荧光结果显示,双酶消化法纯度[(95.29±1.71)%]高于单酶消化法[(72.41±2.16)%](P<0.05),两种方法 P3代细胞生长曲线差异无统计学意义(P>0.05)。结论在短时间内,用双酶消化法联合半植块法、差速消化法、差速贴壁法以及抗有丝分裂法可获得足量和高纯度的SCs。

新生大鼠心肌telocytes在体外培养状态下的分裂方式

目的探讨体外培养新生大鼠心肌telocytes的分裂方式。方法采用0.1%胶原酶I/0.125%胰蛋白酶联合消化法分离培养新生大鼠心肌telocytes,活细胞工作站动态捕捉和苏木素染色检测telocytes的分裂方式。结果酶联合消化法培养新生大鼠心肌telocytes纯度高、活力好,增殖迅速。无丝分裂时,胞核变大,以出芽方式生长,形成哑铃状细胞核,核芽逐渐拉伸并与母细胞分离。有丝分裂前中期,染色质缩短变粗为染色体,整齐地排列在赤道板处;分裂末期,染色体到达两极,子核已初步形成;胞质分裂期,胞质逐步拉开,形成两个子细胞。在有丝分裂不同时期,心肌telocytes均保持其原有的形态特征。结论体外培养心肌telocytes增殖时有丝分裂和无丝分裂两种方式并存。

改良分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞及诱导分化鉴定

目的采用改良分次酶消化法体外分离培养家兔肌腱干细胞,观察其生物学特性,并进行诱导分化及鉴定。方法无菌条件下取出家兔髌腱组织,分别运用改良的分次酶消化法和酶消化后低密度稀释接种法进行分离、培养、传代,用倒置相差显微镜观察细胞形态特征并绘制两种方法的生长曲线,通过流式细胞鉴定仪检测肌腱干细胞表面抗原标志物的表达,取P3-P4代肌腱干细胞向成骨细胞、成软骨细胞诱导分化并鉴定。结果改良的分次酶消化法较酶消化后低密度稀释接种法细胞增殖速度加快,形态均一,杂质细胞少。分离出的肌腱干细胞表面抗原标志CD90、CD44呈阳性,而CD34、CD14呈阴性,证实之前分离的细胞为肌腱干细胞。鉴定出肌腱干细胞具有向成骨细胞和成软骨细胞分化能力。结论采用改良的分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞简单易行,肌腱干细胞生长及传代速度可观,活性良好,纯度较高。另外,肌腱干细胞的成功分离培养,也为肌腱相关疾病的研究开辟了一条新途径。

改良消化复合植块法培养新生大鼠雪旺细胞

目的探讨改良的单酶消化法与组织贴块法相结合的培养雪旺细胞（SCs）的方法,并与经典植块法和普通消化复合植块法进行比较。方法取新生3～5 d的SD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经,分别采用经典植块法、普通消化复合植块法、改良消化复合植块法培养SCs。培养7 d后进行细胞消化和传代,在显微镜下计数并计算细胞总量。用S-100免疫荧光染色法检测所获细胞的纯度。结果改良消化复合植块法培养的SCs生长增殖速度最快,可获取（1.85±0.13）×10^6个细胞;普通消化复合植块法次之,可获取（1.10±0.10）×10^6个细胞;经典植块法所获SCs的生长增殖速度最慢,可获取（0.77±0.03）×10^6个细胞,3种方法比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。S-100免疫荧光染色结果显示,改良消化复合植块法细胞纯度为（95.73±1.51）%,普通消化复合植块法为（84.66±2.68）%,经典植块法为（74.50±4.23）%,3种方法比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论改良消化复合植块法可以在短时间内获得大量高纯度的SCs,为研究周围神经修复再生奠定良好的基础。

外源酶及其添加时间对鸡饲粮氨基酸消化率影响的研究

30只18周龄的伊莎褐种公鸡随机分为6组,每组5只。一组用于内源氨基酸校正的样品采集。其它5组作强饲试验,其中一组采用常规日粮预试一周并强饲常规日粮;另外四组饲喂加酶日粮,预试期分别为一周、二周、三周及四周,再强饲加酶日粮,氨基酸消化率采用“TME”法测定。结果表明:(1)酶及不同的预试期可使17种氨基酸的表观消化率有不同程度的提高,但提高幅度因不同氨基酸而异。采用加酶日粮预试并强饲可减少氨基酸消化率的变异范围和标准差。(2)与常规日粮组相比,加酶日粮预试一周、二周、三周及四周再强饲,可使总氨基酸表观消化率分别提高3.85、3.49、2.76及4.12个百分点。以预试四周为佳。(3)Sibbald's“TME”法测定鸡加酶饲粮氨基酸消化率时,采用加酶日粮预试一周后强饲为宜。