山羊卵母细胞发育的超微结构研究

本研究用光镜和电镜观察山羊卵巢内发育不同时期卵母细胞的核及胞质成分,并发现其某些变化规律。作者认为,随着卵母细胞发育,高尔基体、线粒体、滑面内质网、皮质颗粒等细胞器不断丰富和增多,并逐渐移向皮质区。在直径1.5～3mm卵泡卵母细胞中,线粒体全都变为带帽状;核仁内出现的纤维中心最多,但尚未发生致密化。到直径3.5～5mm卵泡,颗粒细胞突起开始退化,卵母细胞微绒毛自透明带中退缩,此期卵母细胞可用于体外培养成熟。当卵母细胞成熟时,高尔基体和粗面内质网消失,皮质颗粒整齐排列在质膜下,线粒体分散在胞质中央,为受精作好了准备。

OPS玻璃化冷冻对山羊卵母细胞超微结构的影响

对山羊不同发育阶段卵母细胞ＯＰＳ玻璃化冷冻的超微结构损伤进行了电镜观察。结果表明，卵丘细胞除内质网扩张外，未见其他明显的结构损伤；卵母细胞的质膜损伤以ＧＶ期最为严重，其次为培养９ ｈ的，ＩＶＭ 的最轻；ＧＶ期卵几乎看不到微绒毛，而培养９ ｈ和ＩＶＭ卵微绒毛保存较好；ＧＶ期卵母细胞线粒体有的发生了损 伤，主要表现在嵴不清或扩张，培养９ ｈ和ＩＶＭ卵母细胞的线粒体基本上保持了正常的结构；培养９ ｈ卵母细胞的 内质同发生了扩张，ＩＶＭ卵母细胞内质网结构正常。

猪卵母细胞体外成熟与体外受精的超微结构研究

取猪卵巢，从２～６ｍｍ有腔卵泡中抽取未成熟的卵丘卵母细胞复合体。分组处理后，各取１０枚按常规方法制片，光镜和电镜下观察测量。结果表明，对照组的卵丘细胞呈多层包围卵母细胞，其胞质突起与卵母细胞微绒毛交叉伸入透明带中，卵周隙尚未出现。高尔基复合体在卵皮质区成团分布。皮质颗粒位置分散。线粒体多成群存在于卵皮质区，嵴少，基质密度高。脂滴遍布胞质，由间断的滑面内质网包统。培养成熟后，卵丘细胞扩展松散，其突起和卵母细胞微绒毛，均自透明带中缩回，卵周隙出现。皮质颗粒成排贴于质膜下。高尔基复合体未见或仅残留少量囊泡。线粒体中出现空泡。脂滴内絮状物增多。卵母细胞生发泡破裂，第一极体分出，核处于第２次成熟分裂中期。受精后皮质颗粒内容物外倾或颗粒完整外排，线粒体多呈圆形。雌、雄原核形成，致密核仁出现。结果说明，体外受精与体内受精过程基本相同，仅有某些环节不完整或不规则。

山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精

从屠宰场采集卵巢。抽吸法回收2～6mm大腔卵泡卵母细胞。随机抽样后，测量其直径为167.42±17.43μp。A，B级卵泡卵母细胞进行体外成熟培养，其成熟率为67.50％。山羊新鲜精液以BO液或MD-H液处理后，与体外成熟卵母细胞进行授精，受精率分别为56.61％（17／30）和63.33％（19／30），两组间差异不显著（P＞0.05）。BO和MD-H液均适宜于山羊精子获能处理。体外受精卵的2细胞胚发育率为16.67％（6／36），4细胞胚发育率为2.78％（1／36）。

卵丘细胞对辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

为了进一步探索辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟的方法,本试验以屠宰场绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集直径大于2 mm卵泡的卵母细胞,研究卵丘细胞对卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响。试验1,将一部分COCs经机械吹打脱除卵丘细胞成为机械裸卵(DOs),然后以4种方式培养,即COCs单独培养、DOs与COCs共培养(DOs(COCs))、DOs与卵丘颗粒细胞共培养(DOs(CCs)),以及DOs单独培养。试验2,根据包裹卵母细胞的卵丘细胞的完整性分为3组,有3层卵丘细胞紧密包围的卵母细胞复合体COCs3,有1-3层卵丘细胞包围的卵母细胞COCs1-3,无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞NOs,3组各自单独培养。结果表明:COCs组的成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率最高,分别为83.25%、41.75%和29.25%,卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟和随后的发育,COCs3组成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率分别为83.25%、42.50%和29.75%,显著高于COCs1-3和NOs组,卵丘细胞的完整性也影响着卵母细胞的体外发育,自然裸卵已失去体外发育能力。

山羊卵泡卵母细胞的采集及体外成熟效果研究

为了获取高质量的卵泡卵母细胞,提高山羊体外胚胎生产的效率,采用切剖法与抽吸法采集卵泡卵母细胞,并对获得的可用卵母细胞进行了体外成熟培养。结果表明,切剖法能够获得较多的可用卵母细胞,可以明显增加用于体外成熟的卵母细胞数;卵母细胞的体外成熟率与卵泡直径密切相关,大卵泡与中卵泡的卵母细胞成熟率明显高于(P<0.05)小卵泡;山羊卵泡卵母细胞的体外成熟培养液中FCS的添加比例以10%～15%为益。在一定范围内,提高FCS的浓度,并不能提高卵母细胞的成熟率。

来源和质量不同对山羊卵母细胞体外成熟率的影响

比较了卵母细胞级别对体外成熟率的影响,以及促卵泡素(FSH)处理山羊对卵母细胞采集的数量和质量的影响。结果表明:卵母细胞级别对体外成熟率有显著影响,不论是来源于FSH处理卵巢还是屠宰场卵巢,均是A、B级卵母细胞的成熟率高于C级卵母细胞,差异极显著(P<0.01)。但是A、B级卵母细胞之间差异不显著;卵巢来源对卵母细胞采集的数量和质量有显著影响,A、B级卵母细胞在获卵总数中所占的比例,平均每个卵巢获卵母细胞数及A、B级卵母细胞数,均是FSH处理卵巢高于屠宰场卵巢,差异显著(P<0.05);卵巢来源对卵母细胞体外成熟率有显著影响,来自于FSH处理卵巢的卵母细胞体外成熟率高于屠宰场卵巢(81.6%比67.6%),差异极显著(P<0.01)。

山羊卵泡卵母细胞体外成熟的研究

研究了ＦＣＳ，１７β－Ｅ２，ＦＳＨ，ＬＨ对山羊卵泡卵母细胞成熟的作用，及培养时间对卵母细胞核和细胞质成熟的影响。结果表明，添加体积分数为１０％～１５％的ＦＣＳ，１～２ｍｇ·Ｌ－１１７β－Ｅ２，２０～５０ｍｇ·Ｌ－１ＬＨ和１０ｍｇ·Ｌ－１ＦＳＨ有利于提高卵母细胞核成熟，并放出第一极体。而成熟培养２０，２４ｈ的卵母细胞成熟率显著高于培养１６ｈ（Ｐ＜０．０５），核成熟后培养３～４ｈ有利于卵母细胞质成熟，对其后的受精、卵裂及胚胎的进一步发育有重大影响。且ＴＣＭ１９９＋质量分数为１０％～１５％的ＦＣＳ＋１～２ｍｇ·Ｌ－１１７β－Ｅ２＋１０ｍｇ·Ｌ－１ＦＳＨ＋２０～５０ｍｇ·Ｌ－１ＬＨ是卵母细胞成熟的理想培养系统。

山羊卵巢卵母细胞的体外成熟

将234枚卵丘细胞层完整致密的卵母细胞分别培养于含有10％FCS的TCM_(199)+hCG(20μg/mL)、TCM_(199)+hCG+17β—E_2(1μg/mL)和Ham＇s F_(12)+hCG+17β—E_2三种培养基中,培养24—26h,其成熟率分别为55.6％(15/27)、79.4％(104/131)和76.3％(58/76)。结果表明:TCM_(199)和Ham＇s F_(12)都是山羊卵母细胞体外成熟的合适培养基;雌激素的存在对其成熟是有益的(P<0.05)。

山羊卵泡卵母细胞体外成熟的研究

为了建立针对山羊卵母细胞的理想体外成熟培养体系，对山羊卵泡卵母细胞的采集方法，FSH和LH对山羊卵泡卵母细胞体外成熟的作用，及培养时间对卵母细胞体外成熟的影响进行了研究。结果表明：采用切割法平均每枚卵巢采集到的A，B级卵母细胞的数量明显多于抽吸法；采用TCM199添加体积分数为10％FCS，1—2mg／L17β-B，10mmol／LHepes，0．12mg／mL丙酮酸钠，0．1mg／mL链霉素和0．125mg／mL青霉素，10mg／LFSH及20—50mg／LLH的培养体系，有利于山羊卵母细胞的体外成熟，并放出第一极体。山羊卵母细胞体外成熟培养20，22，24h，成熟率显著高于培养18，26，30h（P〈0．05）。

猪卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化

为研究猪未成熟期(GV期)和体外成熟期(MⅡ期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化,随机取新鲜与冷冻-解冻后的GV期和MⅡ期卵母细胞制备电镜标本。GV期和MⅡ卵母细胞分3组进行处理:Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为GV期卵母细胞冷冻组,Ⅲ组为MⅡ期卵母细胞冷冻组。结果表明,所用玻璃化冷冻程序更适用于猪GV期卵母细胞的冷冻保存,GV期冷冻组卵母细胞的二乙酸荧光素(FDA)染色存活率、卵裂率均明显高于MⅡ期卵母细胞冷冻组。透射电镜观察结果发现,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,主要表现为部分卵丘-卵母细胞复合体(COC)发生卵丘细胞脱落,透明带破损,卵丘细胞碎裂,卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏,卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少,卵母细胞内脂滴多呈均质状。而MⅡ期卵母细胞冷冻后,皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下,仅可见形态不规则的不均质脂滴,其周围常严重空泡化。试验表明,采用适当的冷冻方案,可以获得少量源于冷冻保存的猪GV期卵母细胞的胚胎。而猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,经体外受精未见卵裂,脂滴严重空泡化是其最为明显的变化。

血管内皮生长因子对体外成熟绵羊卵母细胞超微结构变化的影响

为研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞超微结构变化的影响,根据前期研究结果,在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng.mL-1和试验组5 ng.mL-1)进行成熟培养。利用透射电镜技术进行分析,研究结果显示:①VEGF加速了微绒毛的发育和变化,促进了微绒毛游离端斜行插入透明带,增加了细胞内外物质交流和养分的吸收;②VEGF对卵母细胞成熟过程中高尔基体的影响不显著;③发现特征性绵羊卵母细胞线粒体———带帽状线粒体,并且VEGF对线粒体的迁移有一定的促进作用;④VEGF的添加对绵羊卵母细胞体外成熟过程中脂滴数量的增加没有显著的作用,但VEGF减少了小脂滴聚集为大脂滴的数量。

山羊小腔卵泡卵母细胞的体外受精试验

抽吸法采集2～6mm山羊卵巢大腔卵泡卵母细胞后，以1．5mm间距纵横切割卵巢，回收（2mm小腔卵泡卵母细胞。随机测量其直径为129．86±18.84μm。将218枚卵丘细胞层致密完整的卵母细胞分别培养于含颗粒细胞并用20mMHEPES缓冲的①TCM199＋15％GS，②①＋FSH，LH（10μg／mL）＋17β-E2（1μg／ml。），③②＋ITS（5μs／mLInsulin，Transferrln，5ng／mLSodiumselenite），④TCM199＋15％NCS＋FSH，LH，17β—E2中培养26～28h，其在熟率为19．35％（6／31），26．53％（26／98），29．45％（43／146），20．74％（11／53）。体外成熟卵母细胞与体外获能的新鲜精子授精，受精率为32．94％（28／85），2细胞胚发育率为7．14％（2／28）。

磷酸二酯酶抑制剂对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

哺乳动物有腔卵泡中的卵母细胞在体外会自发恢复减数分裂,适当延迟减数分裂的自发恢复,能促进核与胞质成熟的同步化,有利于后续胚胎的发育。本试验研究了磷酸二酯酶3(PDE 3)特异性抑制剂milrinone对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。结果表明,milrinone抑制山羊卵母细胞体外成熟的时间为6 h,其最佳剂量为100μmol/L,经milrinone处理体外培养28 h成熟的山羊卵母细胞用于孤雌激活,能显著提高孤雌激活胚的卵裂率及囊胚率。说明成熟培养液中添加适当剂量的milrinone,能显著提高体外成熟的山羊卵母细胞的质量。

体外培养的人卵母细胞的超微结构

目的探讨体外培养的人卵母细胞的超微结构。方法用光镜观察体外培养前生发泡期(GV期)、培养后生发泡破裂但仍处于MⅠ期的未成熟卵母细胞和达到MⅡ期的成熟卵母细胞的形态,并将成熟卵母细胞分为优质与非优质;用透射电镜观察卵母细胞的超微结构。结果GV期卵母细胞微绒毛短小稀少;核偏一侧,核仁致密。培养后卵母细胞微绒毛粗大增多,细胞器丰富,高尔基体周围有许多分泌小泡;线粒体和脂滴伴行;卵丘细胞的胞质突起与卵母细胞的微绒毛间形成缝隙连接,卵丘细胞之间形成较多桥粒。成熟的卵母细胞粗面内质网、高尔基体减少,滑面内质网发达,线粒体幼稚化,脂滴融合,皮质颗粒沿质膜下呈线性排列,细胞连接减少,第一极体含多种细胞器。非优质卵母细胞线粒体大量存在膜和嵴模糊、膨大的现象,有的极体碎裂,透明带形态不正常,其周围卵丘细胞的凋亡率较高。结论揭示了体外培养的不同时期、不同质量的人卵母细胞的超微结构。

山羊卵泡卵母细胞的采集与体外成熟研究

为了建立针对山羊卵母细胞的理想体外成熟培养体系,研究了山羊卵泡卵母细胞的采集方法和采集获得的可用卵母细胞的体外成熟培养条件,结果表明:切割法能够获得较多的可用卵母细胞,且明显增加了用于体外成熟的卵母细胞数;卵母细胞在37.0℃下培养的成熟率显著低于在38.5℃、39.0℃下培养的成熟率(P<0.05);卵母细胞培养18 h和培养20h的成熟率极显著低于培养24 h和培养26 h的成熟率(P<0.01);此外,卵母细胞体外成熟培养时,培养液中的胎牛血清添加量以10%～15%为宜。

山羊卵母细胞孤雌激活和孤雌胚体外发育的研究

用离子霉素、乙醇、电刺激和Ca—A23187对体外成熟山羊卵泡卵母细胞的孤雌激活和孤雌胚体外发育进行了较为系统的研究。结果表明：2．5，5．0，10．0μmol／L离子霉素对卵母细胞激活率分别为54．0％，58．2％，57．9％，孤雌胚发育率分别为1．5％，3．4％，0％，激活率和发育率均无显著差异（P〉0．05）。5．0，10．0，15．0，20．0μmol/L Ca-A23187对卵母细胞激活率分别为31．0％，46．4％，41．8％，45．8％，其中5．0μmol／L Ca-A23187激活率显著低于其他处理组（P〈0．05）。5．0μmol／L处理大于4_细胞发育率，极显著低于10．0μmol／L和20．0μmol／L处理（P〈0．01），显著低于15．0μmol／L处理（P〈0．05）。3％，7％，11％和15％乙醇对卵母细胞激活率分别为40．0％、61．4％、63．0％和67．9％，其中3％乙醇活化率极显著低于其他各组（P〈0．01）。15％乙醇致卵母细胞死亡率为15．4％，显著高于其他各组（P〈0．05）。7％和11％乙醇处理2～4-细胞和大于4-细胞的发育率，均显著高于3％和15％乙醇处理（P〈0．05）。15％乙醇处理大于8．细胞的发育率，极显著低于7％乙醇（P〈0．01），显著低于11％乙醇（P〈0．05）。在含Ca^2＋电激液中，用1．00，1．25，1．50，1．80kV／cm电压刺激卵母细胞，活化率分别为48．4％，54．3％，55．8％，45．1％，2—4细胞卵裂率分别为52．3％，57．9％，54．7％，53．1％，差异均不显著（P〈0．05）。

ROS对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

【目的】研究周期依赖性蛋白激酶抑制剂(Roscovitine,ROS)对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。【方法】将山羊卵母细胞置于含不同浓度(0(对照),20,40,80,120,160,200μmol/L)ROS的成熟液中培养24h统计第一极体排出率,初步筛选山羊卵母细胞成熟培养液中添加ROS的有效浓度;将山羊卵母细胞在含不同浓度(0(对照),40,80,120,160,200μmol/L)ROS的抑制培养液中培养8或16h,再转入常规培养液中培养至24h,统计第一极体排出率,确定ROS适宜的浓度和作用时间。将卵母细胞放入添加40μmol/L ROS的培养液微滴中进行抑制培养,抑制培养8h后分别再常规培养0,2,4,6,8,10,12,14,16h,统计各处理第一极体排出率。将山羊卵母细胞在最佳ROS处理方案下抑制培养后进行孤雌激活,观察孤雌胚的发育情况。【结果】成熟培养液中加入40μmol/LROS抑制培养山羊卵母细胞8h后再转入常规培养液中培养至24h,是比较理想的ROS处理方案。山羊卵母细胞成熟培养的16h以前,全程抑制和抑制8h再常规培养2个试验组第一极体排出率与常规对照组无显著差异;分别培养18,20,22h时,2个试验组第一极体排出率均极显著低于对照组;24h时,抑制8h再常规培养组第一极体排出率(58.76%)与对照组(63.13%)接近,无显著差异。试验组成熟卵母细胞孤雌激活胚的囊胚率(46.75%)显著高于对照组(36.04%,P<0.05)。【结论】山羊COCs成熟培养液中加入40μmol/L ROS培养8h再转入常规培养液培养至24h,是山羊卵母细胞核质同步成熟较适宜的方案,此方案可以有效抑制18～22h核成熟卵母细胞的减数分裂恢复,推迟4～6h成熟,达到培养24h核质同步成熟的目的,提高了体外培养卵母细胞的质量。

重组牛生长激素对山羊卵泡卵母细胞体外成熟的影响

将３０７枚Ａ、Ｂ级卵丘－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）分别培养于：改良ＴＣＭ１９９＋ＦＳＨ（１０μｇ／ｍｌ）＋ＬＨ（２０μｇ／ｍｌ）＋２０％ＮＣＳ（Ａ液）、Ａ液＋重组牛生长激素（ｒｂＧＨ）１５ｎｇ／ｍｌ、改良ＴＣＭ１９９＋ｈＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）＋ｒｂＧＨ＋２０％ＮＣＳ三种培养基中，获得５３１％、６７９％和６３５％的成熟率。结果表明，ｒｂＧＨ对山羊卵泡卵母细胞的体外成熟是有益的。

山羊腔前卵泡卵母细胞体外发育与体外成熟的研究

通过比较 3种培养基、5个培养系统和 4种培养方法对卵母细胞生长率的影响 ,结果发现 ,就卵母细胞生长率而言 ,以MEMHEPES培养液 +5%FCS +40 μg/mlFSH +2 0ng/mlIGF- 1+2mmol/LcAMP +2mmol/L次黄嘌呤培养系统为佳。在腔前卵泡体外培养过程中 ,12个卵泡经腔期发育 ,约占同等培养条件下卵泡总数的 2 % ( 12 / 60 3)。培养卵泡经腔期发育 ,并未改善其卵母细胞的成熟率 ( 0 / 12 )。腔前卵泡卵母细胞经过不同时间的体外培养 ,发现经 12和 14d培养结束的卵母细胞中 ,有 81% ( 4 7/ 58)生发泡明显迁移至质膜下 ;培养 14d的卵母细胞中 ,约 16 4 %( 9/ 55)产生 pbI但不排出 ,因而可在胞质中见到极体 ;培养 16d得到 1枚排出 pbI的孤雌激活卵 ;同时发现培养 16～ 18d卵母细胞退化率明显增高 (P <0 0 1)。推测山羊腔前卵泡卵母细胞体外培养的适宜时间为 16d。