孤啡肽在大鼠脑内对抗吗啡镇痛

脑内全新的阿片受体样（opioidreceptor-like，ORL）受体（1994）及其内源性配体（orphaninFQ，OFQ）孤啡肽（1995）的发现形成了中枢神经系统阿片／抗阿片相互关系的研究领域中一个新的推动力。基于它们与阿片家族的高同源性及在脑内痛觉整合相关区域的丰富表达，本实验观察了OFQ在大鼠脑内对吗啡镇痛作用的影响。结果表明：（1）OFQ可以对抗脑室注射生理盐水引起的镇痛，后者可能是一种由内源性阿片系统介导的应激镇痛。（2）脑室注射OFQ在很大的剂量范围（40fmol到50nmol）内能翻转吗啡镇痛。（3）用OFQ受体反义寡核苷酸阻断中枢ORL受体的表达，可加强吗啡的累加镇痛效应。提示孤啡肽在大鼠脑内很可能作为一种抗阿片肽发挥作用。

孤啡肽研究进展

１９９５ 年底，发现了１ 种新型的内源性阿片肽———孤啡肽（ Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ 或 Ｏｒｐｈａｎｉｎ Ｆ Ｑ） ，它是１９９４ 年发现的阿片受体样（ Ｏ Ｒ Ｌ１ 或 Ｌ Ｃ１３２） 受体的内源性配体，它与受体结合后介导许多不同于经典阿片受体的生理活动。对孤啡肽的参与痛觉调节、神经传递、对离子通道和心血管系统的影响，以及拮抗剂与阻断剂。

阿片受体样受体ORL_1基因在大鼠脑内的表达

我们采用地高辛（digoxigenin）标记的寡聚核苷酸探针和原位杂交技术研究了新发现的阿片受体样受体ORL1基因在正常大鼠脑内的表达和分布。发现ORL1基因在大鼠脑内广泛表达，尤其在大脑皮层、丘脑、下丘脑、杏仁核、海马、隔核、缰核、导水管周围灰质、中缝核群及蓝斑等区域。提示ORL1除参与痛觉调制外，还可能参与脑内多项生理功能的调控。

疼痛及针刺镇痛时孤啡呔受体mRNA的变化

目的：观察大鼠在福尔马林致痛及针刺镇痛时孤啡肽受体ｍＲＮＡ在一些与镇痛有关核团的变化情况。方法：采用原位杂交组织化学技术。结果：电针后１０ｈ，导水管周围腹侧区、中缝背核及中缝大核内孤啡肽受体ｍＲＮＡ阳性神经元数增多；而在大鼠脚掌注射福尔马林后，上述核团内孤啡肽受体ｍＲＮＡ阳性神经元数却明显减少；电针并注射福尔马林，脑内孤啡肽受体ｍＲＮＡ水平介于单用电针和福尔马林之间。结论：电针能促进孤啡肽受体的合成而伤害性刺激抑制孤啡肽受体的合成。

Toll样受体4在吗啡应用和耐受中的作用

Toll样受体4(Toll-like receptor 4)是主要表达于小胶质细胞表面开启哺乳动物先天免疫反应的重要受体.近年研究表明,TLR4参与疼痛及炎症的形成.TLR4能够被吗啡激活,其结果导致小胶质细胞活化,细胞因子合成和释放增加,从而提高疼痛感受细胞的兴奋性,减小或抵消吗啡的镇痛作用,即形成吗啡耐受.抑制TLR4可以增加吗啡的镇痛作用,减缓吗啡耐受的形成.TLR4与经典阿片受体之间存在立体选择特异性差异,(-)和(+)吗啡均能使之激活.吗啡-TLR4-胶质细胞作用链的研究为治疗吗啡耐受产生提供新的路径.

脊髓小胶质细胞Toll样受体4和κ阿片受体的相互作用参与针刺镇痛的机制研究

目的:观察电针对慢性神经病理性疼痛大鼠脊髓小胶质细胞Toll样受体4(TLR4)和κ阿片受体(KOR)表达的影响,探讨脊髓小胶质细胞自身受体的相互作用参与电针镇痛的机制。方法:Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、电针组和电针+抑制剂组,每组18只。结扎大鼠坐骨神经造成慢性压迫性损伤(CCI)疼痛模型。电针组、电针+抑制剂组于CCI术后第8天开始电针双侧"足三里""阳陵泉"(1 mA,2 Hz/15 Hz),30 min/次,1次/d,连续5 d;电针+抑制剂组于首次电针前给予大鼠腹腔注射KOR抑制剂JDTic(10 mg/kg)。用足底测痛仪测定大鼠双足对热刺激的缩足反应潜伏期(PWL);用免疫荧光法检测脊髓腰(L)2—L4段中小胶质细胞的形态和数量;用放射免疫法检测脊髓中强啡肽的含量;免疫磁珠法分离脊髓L2—L4段中的小胶质细胞后,用荧光定量PCR法检测脊髓和小胶质细胞中CD68和KOR mRNA的表达;用Western blot法检测小胶质细胞中TLR4蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠患健侧PWL差值(PWLD)明显增大(P<0.01),脊髓背角小胶质细胞标志物Iba-1和CD68 mRNA表达及脊髓小胶质细胞上TLR4蛋白表达均上升(P<0.01),脊髓背角小胶质细胞胞体增大、突起增多。干预后与模型组比较,电针组大鼠的PWLD减小(P<0.05),脊髓背角Iba-1和CD68mRNA表达降低(P<0.05),小胶质细胞胞体变小,强啡肽含量升高(P<0.05),小胶质细胞上TLR4蛋白表达下降(P<0.05),而KOR mRNA表达升高(P<0.05)。干预后与电针组比较,电针+抑制剂组大鼠的PWLD明显增大(P<0.05),脊髓背角Iba-1、CD68mRNA表达升高(P<0.05),小胶质细胞上TLR4蛋白表达升高(P<0.05),而KOR mRNA表达降低(P<0.05)。结论:电针对慢性神经病理性疼痛的镇痛机制可能与增强脊髓小胶质细胞上KOR mRNA表达,从而抑制小胶质细胞上TLR4诱导的致痛信号有关。

κ阿片受体激动剂通过调控Toll样受体4/核因子-κB信号通路保护大鼠缺血再灌注心肌

目的 研究选择性κ阿片受体（κ-opioid receptor,κ-OR）激动剂U50,488H对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用,及其与Toll样受体4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信号通路的关系.方法 成年健康雄性SD大鼠,体质量250 ～ 300 g,由第四军医大学动物实验中心提供.采用随机区组法将大鼠分为未阻断左前降支血流的对照组,心肌缺血再灌注组（I/R组）,使用U50,488H的心肌缺血再灌注组（I/R＋ U50组）以及加用κ-OR特异性阻断剂Nor-BNI和U50,488H的心肌缺血再灌注组（I/R＋ U50＋N组）.使用丝线短暂阻断大鼠冠状动脉左前降支血流30 min,再灌注120 min,建立大鼠心肌缺血再灌注模型.在缺血前由静脉选择注射U50,488H和（或）κ-OR激动剂的阻断剂（Nor-BNI）.对照组接受相同的手术过程,但未阻断左前降支血流.采用伊文思蓝和TTC染色检测大鼠心肌梗死面积.观察心律失常发生情况并计算心律失常评分.灌注结束后分别选取心肌梗死后的梗死区域、缺血区域、临近缺血区域的正常心肌区域（危险区域）检测TLR4、NF-κB、肿瘤坏死因-α（TNF-α）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平.结果 I/R＋ U50组大鼠心肌梗死面积小于I/R组（P＜0.01）,而I/R＋U50＋N组则大于I/R＋ U50组（P＜0.01）.I/R＋ U50组大鼠室性心动过速和心室颤动的发生率均低于I/R组（P均＜0.01）,心律失常评分亦低于I/R组（2.9＆#177;0.7比4.4＆#177;0.9,P＜0.05）.而I/R＋ U50＋N组室性心动过速和心室颤动的发生率均高于I/R＋U50组（P均＜0.01）,心律失常评分亦高于I/R＋ U50组（4.5＆#177;0.8比2.9＆#177;0.7,P＜0.01）.I/R＋ U50组大鼠心肌缺血区域和危险区域中的TLR4、NF-κB、TNF-α和MPO的表达水平均低于I/R组（P均＜0.01）,而I/R＋ U50＋N组则均高于I/R＋ U50组（P均＜0.01）.结论 κ-OR激动剂U50,488H对大鼠缺血再灌注心肌具有保护作用,且该作用可能是通过TLR4/NF-κB信号通路实现的.

人重组阿片受体样受体在CHO细胞稳定表达系统的建立

目的:在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上稳定转染人重组阿片受体样受体(hORL1),为体外高通量筛选hORL1受体作用药物及相关药物分子机制研究奠定基础。方法:用脂质体介导法将pcDNA3.1(+)-hORL1重组质粒稳定转染到缺乏hORL1的CHO细胞中,然后用含G418的选择性培养液进行筛选,挑取耐药克隆;用放射性配体-受体结合实验进一步筛选阳性克隆,对阳性克隆受体亲和力和表达量进行分析,用[35S]GTPγS结合实验分析表达受体的功能。结果与结论:在稳定转染hORL1的克隆细胞中,[3H]伤害感受肽的Kd和Bmax值分别为(0.44±0.21)nmol/L和(0.35±0.06)pmol/mg蛋白。伤害感受肽刺激受体结合[35S]GTPγS的EC50值为3.45nmol/L。以上结果与文献报道的天然hORL1受体的特性相似,说明该细胞株表达的hORL1受体与天然的hORL1受体具有基本一致的生物学特性,证实成功建立了稳定表达人阿片受体样受体的细胞模型。