Car-R/Ceph-S的铜绿假单胞菌OprD基因突变分析

目的 研究对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感(carbapenem-resistant but cephalosporin-susceptible,Car-R/Ceph-S)的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中OprD基因的突变类型。方法 对2021年1月至2021年3月昆明医科大学第一附属医院临床分离的10株对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感的铜绿假单胞菌进行分离培养;使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测该表型铜绿假单胞菌中OprD基因的携带情况,并测序分析OprD基因的突变类型。结果 10株菌株均显示出明显的OprD扩增条带,测序分析显示有以下突变类型,分别是移码突变2株、氨基酸替代突变8株、提前终止密码子2株、大片段缺失4株。结论 对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感(Car-R/Ceph-S)的铜绿假单胞菌中OprD基因的突变类型呈多样化,点突变频率最高,还有大片段的缺失以及提前终止密码子。这些突变导致OprD结构发生改变,从而使得耐药现象的发生。

铜绿假单胞菌oprD基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗的免疫效果研究

为探究铜绿假单胞菌oprD基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗的免疫效果,本研究经PCR扩增铜绿假单胞菌oprD基因,将其克隆于真核表达载体pcaggs-HA中,构建重组质粒pOPRD。同时将oprD基因克隆于原核表达载体pET32a中构建重组质粒,随后将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达并纯化后制备该基因的重组亚单位疫苗。分别以pOPRD质粒和重组亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠,同时设置pOPRD初免-重组亚单位疫苗加强免疫组、灭活疫苗(本研究室制备)免疫组、铜绿假单胞菌外膜蛋白(本研究室制备)免疫组以及pcaggs-HA空载体对照组和PBS对照组。免疫后采用间接ELISA测定小鼠血清抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗夹心ELISA测定脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4的水平。结果显示各疫苗均可诱导免疫小鼠产生较高水平的血清抗体,初免-加强免疫组小鼠脾细胞的增殖指数(SI)值及小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4含量显著高于DNA疫苗组和重组亚单位疫苗组(P<0.05)。三免两周后以铜绿假单胞菌强毒株CAV0792对各组小鼠进行攻毒试验,测定攻毒后各组小鼠的保护率,结果显示DNA疫苗组、重组亚单位疫苗组、初免-加强免疫组、外膜蛋白疫苗组和灭活疫苗组的保护率分别为53.3%、60%、73.3%、80%和93.3%。本研究首次证实以铜绿假单胞菌oprD基因制备的DNA疫苗和重组亚单位疫苗均可诱导小鼠产生免疫应答,并为其提供对铜绿假单胞菌感染的免疫保护,且两者以初免-加强免疫的方式诱导的免疫应答水平更高、保护效果更好。本研究为铜绿假单胞菌DNA疫苗和重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。

铜绿假单胞菌亚胺培南中介菌株oprD基因分析

目的分析铜绿假单胞菌临床分离株对亚胺培南耐药机制。方法采用VITEK32系统分析临床菌株耐药性;纸片协同法和纸片扩散法分析金属β内酰胺酶和AmpC β内酰胺酶活性;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分析临床菌株的外膜蛋白OprD的表达;PCR法扩增基因oprD并测序分析;随机扩增多态性DNA标记方法对临床菌株进行分型。结果 7株菌确认为亚胺培南中介株,其中2株菌外膜通道蛋白OprD可能存在缺失,进一步分析发现其编码基因被插入序列ISRP10阻断。其余5株菌OprD蛋白大小存在差异,相应编码区大小为427~443个氨基酸,OprD蛋白二级结构转角区域L1-L8处均存在多种氨基酸替代或缺失。结论铜绿假单胞菌被插入序列ISRP10阻断失能,或其外膜蛋白基因oprD及OprD蛋白二级结构转角区域的氨基酸突变,导致临床分离株对亚胺培南呈中介。

东莞地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌oprD基因分析

目的:分析东莞地区oprD基因突变对耐亚胺培南铜绿假单胞菌的作用。方法:收集2016年至2017年东莞地区2家医院的110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床分离株,PCR法扩增基因oprD并测序分析其序列突变类型。结果:110株确认为亚胺培南耐药菌株,其中3株oprD基因PCR扩增阴性。余107株阳性菌株进行oprD基因测序发现其中7株无突变,84株有框码移位(其中有8株发现携带插入序列ISPpu21、IS1394、ISPpu29以及ISPst2),16株有终止密码子提前出现(形成1个位置提前的新终止密码子进而引起其肽链异常),基因突变率高达90.91%。结论:广东东莞地区铜绿假单胞菌oprD基因突变导致其氨基酸改变或(和)移码突变,影响oprD与IMP结合是本组铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制。

铜绿假单胞菌oprD基因的克隆、表达与纯化

试验研究铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因oprD在大肠杆菌中的克隆及异源表达与纯化。试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌oprD基因序列,设计合成了一对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了该目的基因,随后将其克隆于原核表达载体pET32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并优化了表达条件,同时对表达的蛋白进行纯化。结果显示,试验成功构建了重组载体pET32a-oprD,oprD与组氨酸(His)标签形成的融合蛋白约为65 kD。最佳表达条件为菌液培养5 h时加入0.7 mmol/L的IPTG,37℃下诱导4.5 h,纯化的蛋白经SDS-PAGE分析获得了较高纯度的OPRD重组蛋白。研究结果可以为铜绿假单胞菌OPRD蛋白功能研究及其相关诊断试剂和疫苗的研制提供参考。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制的研究

目的探讨耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制。方法收集2016年1月至2017年12月东莞地区2家医院110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌,采用VITEK2系统分析临床菌株耐药性,脉冲场凝胶电泳(PFGE)行同源性分析,PCR法检测金属β?内酰胺酶相关基因以及oprD基因,并对阳性株进行测序;对oprD基因无中断突变株,利用qRT?PCR检测其mRNA表达情况。结果 110株耐亚胺培南铜绿单胞菌PFGE分析结果显示高度克隆多样性。PCR法检测出18株金属β?内酰胺酶基因阳性的菌株,主要类型是:IMP?25,VIM?2,SIM?2。PCR法检测出107株阳性菌株,测序结果表明有意突变率高达93.46%(100/107),类型包括点突变,缺失突变,插入突变以及提早终止突变。7株oprD mRNA表达量均降低。结论本实验进一步证实了oprD基因缺失,发生广泛有意突变,mRNA表达减少以及金属β?内酰胺酶基因产生是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制。

2011-2013年河北地区医院烧伤患者铜绿假单胞菌耐药株oprD基因突变分析

目的分析铜绿假单胞菌oprD基因突变情况及其与耐药性的关系,以指导烧伤患者感染的临床治疗。方法采用体外药敏试验分析铜绿假单胞菌的耐药情况,然后进行oprD基因的PCR扩增,采用双脱氧链末端终止法对其进行测序分析。结果药敏试验中头孢噻肟、氨苄西林、头孢唑林对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径均为6mm,即该菌对上述抗生素均具有耐药性。头孢哌酮、哌拉西林、头孢吡肟、美罗培南、阿米卡星、环丙沙星对铜绿假单胞菌的抑菌环直径范围分别为6~22mm、6~20mm、6~20mm,6~28mm,6~22mm和6~32mm,即该菌对这6种抗生素产生了不同程度的耐药。美罗培南最大抑菌直径为28mm,环丙沙星为32mm,可优先用于治疗烧伤患者铜绿假单胞菌感染。通过PCR扩增oprD基因,其大小为1 340bp;采用双脱氧链终止法对铜绿假单胞菌菌株oprD基因测序,在279位发生C→G的碱基替换,302位发生T→C的碱基替换,334位发生A→G的碱基替换,350位发生T→C的碱基替换,380位发生A→G的突变。结论 oprD基因缺失或其基因片段上的碱基替换引起的基因突变与铜绿假单胞菌的耐药性密切相关,可供烧伤患者感染的临床治疗及抗生素使用提供指导。

耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶与膜孔蛋白carO、oprD基因研究

目的调查耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶与膜孔蛋白carO、oprD基因存在的状况,为临床资料提供参考依据。方法收集2008年1-12月医院住院患者痰液标本中分离的耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌共20株,用gyrA基因作分子鉴定,再用聚合酶链反应的方法分析13种A类β-内酰胺酶基因、10种B类β-内酰胺酶基因、2种C类β-内酰胺酶基因、8种D类β-内酰胺酶基因及膜孔蛋白carO和oprD基因。结果 20株耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌均检出A类β-内酰胺酶基因TEM-1型、C类β-内酰胺酶基因ADC-30型、D类β-内酰胺酶基因OXA-23型和OXA-66型;20株耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌的carO和oprD基因测得序列一致,但与鲍氏不动杆菌敏感(SDF)株相比均存在有义突变。结论耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌检出的TEM-1型、ADC-30型、OXA-23型和OXA-66型,carO和oprD基因突变是导致菌株对头孢类药物耐药的主要原因,耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌同时携带TEM-1型、ADC-30型、OXA-23型和OXA-66型基因和存在carO、oprD编码基因突变为国内首次报道。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性特征及oprD基因突变分析

为了分析亚胺培南耐药铜绿假单胞菌(IMPRPAE)临床分离株的耐药性及oprD基因变异情况,本研究收集了2014年1月至2017年12月临床标本中分离的35株IMPRPAE,采用VITEK2-compact系统分析IMPRPAE的耐药性;PCR法扩增基因oprD并测序分析其序列突变类型。IMPRPAE共15株,其中1株oprD基因PCR扩增阴性。余14株阳性菌株进行oprD基因测序发现其中1株无突变,11株有框码移位(其中有2株发现携带插入序列ISPpu21,IS1394),2株有终止密码子提前出现。本研究中铜绿假单胞菌oprD基因突变是亚胺培南耐药的主要原因。