铜绿假单胞菌oprD基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗的免疫效果研究

为探究铜绿假单胞菌oprD基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗的免疫效果,本研究经PCR扩增铜绿假单胞菌oprD基因,将其克隆于真核表达载体pcaggs-HA中,构建重组质粒pOPRD。同时将oprD基因克隆于原核表达载体pET32a中构建重组质粒,随后将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达并纯化后制备该基因的重组亚单位疫苗。分别以pOPRD质粒和重组亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠,同时设置pOPRD初免-重组亚单位疫苗加强免疫组、灭活疫苗(本研究室制备)免疫组、铜绿假单胞菌外膜蛋白(本研究室制备)免疫组以及pcaggs-HA空载体对照组和PBS对照组。免疫后采用间接ELISA测定小鼠血清抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗夹心ELISA测定脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4的水平。结果显示各疫苗均可诱导免疫小鼠产生较高水平的血清抗体,初免-加强免疫组小鼠脾细胞的增殖指数(SI)值及小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4含量显著高于DNA疫苗组和重组亚单位疫苗组(P<0.05)。三免两周后以铜绿假单胞菌强毒株CAV0792对各组小鼠进行攻毒试验,测定攻毒后各组小鼠的保护率,结果显示DNA疫苗组、重组亚单位疫苗组、初免-加强免疫组、外膜蛋白疫苗组和灭活疫苗组的保护率分别为53.3%、60%、73.3%、80%和93.3%。本研究首次证实以铜绿假单胞菌oprD基因制备的DNA疫苗和重组亚单位疫苗均可诱导小鼠产生免疫应答,并为其提供对铜绿假单胞菌感染的免疫保护,且两者以初免-加强免疫的方式诱导的免疫应答水平更高、保护效果更好。本研究为铜绿假单胞菌DNA疫苗和重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。

铜绿假单胞菌亚胺培南中介菌株oprD基因分析

目的分析铜绿假单胞菌临床分离株对亚胺培南耐药机制。方法采用VITEK32系统分析临床菌株耐药性;纸片协同法和纸片扩散法分析金属β内酰胺酶和AmpC β内酰胺酶活性;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分析临床菌株的外膜蛋白OprD的表达;PCR法扩增基因oprD并测序分析;随机扩增多态性DNA标记方法对临床菌株进行分型。结果 7株菌确认为亚胺培南中介株,其中2株菌外膜通道蛋白OprD可能存在缺失,进一步分析发现其编码基因被插入序列ISRP10阻断。其余5株菌OprD蛋白大小存在差异,相应编码区大小为427~443个氨基酸,OprD蛋白二级结构转角区域L1-L8处均存在多种氨基酸替代或缺失。结论铜绿假单胞菌被插入序列ISRP10阻断失能,或其外膜蛋白基因oprD及OprD蛋白二级结构转角区域的氨基酸突变,导致临床分离株对亚胺培南呈中介。

东莞地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌oprD基因分析

目的:分析东莞地区oprD基因突变对耐亚胺培南铜绿假单胞菌的作用。方法:收集2016年至2017年东莞地区2家医院的110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床分离株,PCR法扩增基因oprD并测序分析其序列突变类型。结果:110株确认为亚胺培南耐药菌株,其中3株oprD基因PCR扩增阴性。余107株阳性菌株进行oprD基因测序发现其中7株无突变,84株有框码移位(其中有8株发现携带插入序列ISPpu21、IS1394、ISPpu29以及ISPst2),16株有终止密码子提前出现(形成1个位置提前的新终止密码子进而引起其肽链异常),基因突变率高达90.91%。结论:广东东莞地区铜绿假单胞菌oprD基因突变导致其氨基酸改变或(和)移码突变,影响oprD与IMP结合是本组铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制。

铜绿假单胞菌oprD基因的克隆、表达与纯化

试验研究铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因oprD在大肠杆菌中的克隆及异源表达与纯化。试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌oprD基因序列,设计合成了一对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了该目的基因,随后将其克隆于原核表达载体pET32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并优化了表达条件,同时对表达的蛋白进行纯化。结果显示,试验成功构建了重组载体pET32a-oprD,oprD与组氨酸(His)标签形成的融合蛋白约为65 kD。最佳表达条件为菌液培养5 h时加入0.7 mmol/L的IPTG,37℃下诱导4.5 h,纯化的蛋白经SDS-PAGE分析获得了较高纯度的OPRD重组蛋白。研究结果可以为铜绿假单胞菌OPRD蛋白功能研究及其相关诊断试剂和疫苗的研制提供参考。

尿酸介导OPRD1基因低甲基化影响阿尔茨海默病

探讨OPRD1基因甲基化与尿酸及阿尔茨海默病的相关性,并在细胞实验中证实尿酸可影响OPRD1基因甲基化水平.采集阿尔茨海默病组、高尿酸血症组及健康对照组的静脉血,检测OPRD1基因甲基化水平,并探讨与尿酸水平的相关性.细胞实验中,采用不同尿酸浓度先后处理细胞,分别检测OPRD1基因甲基化水平.结果表明,高尿酸血症组OPRD1基因pos2、pos4位点甲基化水平低于健康对照组,阿尔茨海默病组pos4位点甲基化水平高于健康对照组,尿酸水平与OPRD1基因甲基化水平负相关,高浓度尿酸下细胞OPRD1基因pos2、pos3、pos4位点的甲基化水平更低.由此得出尿酸可能通过介导OPRD1基因pos4位点的低甲基化修饰,从而影响阿尔茨海默病的发病.

2011-2013年河北地区医院烧伤患者铜绿假单胞菌耐药株oprD基因突变分析

目的分析铜绿假单胞菌oprD基因突变情况及其与耐药性的关系,以指导烧伤患者感染的临床治疗。方法采用体外药敏试验分析铜绿假单胞菌的耐药情况,然后进行oprD基因的PCR扩增,采用双脱氧链末端终止法对其进行测序分析。结果药敏试验中头孢噻肟、氨苄西林、头孢唑林对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径均为6mm,即该菌对上述抗生素均具有耐药性。头孢哌酮、哌拉西林、头孢吡肟、美罗培南、阿米卡星、环丙沙星对铜绿假单胞菌的抑菌环直径范围分别为6~22mm、6~20mm、6~20mm,6~28mm,6~22mm和6~32mm,即该菌对这6种抗生素产生了不同程度的耐药。美罗培南最大抑菌直径为28mm,环丙沙星为32mm,可优先用于治疗烧伤患者铜绿假单胞菌感染。通过PCR扩增oprD基因,其大小为1 340bp;采用双脱氧链终止法对铜绿假单胞菌菌株oprD基因测序,在279位发生C→G的碱基替换,302位发生T→C的碱基替换,334位发生A→G的碱基替换,350位发生T→C的碱基替换,380位发生A→G的突变。结论 oprD基因缺失或其基因片段上的碱基替换引起的基因突变与铜绿假单胞菌的耐药性密切相关,可供烧伤患者感染的临床治疗及抗生素使用提供指导。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌膜孔蛋白OprD2基因突变与耐药分析

目的分析耐亚胺培南铜绿假单胞菌膜孔蛋白OprD2基因突变与耐药情况。方法收集2019年1月至2021年12月南京市高淳人民医院临床标本中的亚胺培南耐药与敏感的铜绿假单胞菌株共90株,均进行细菌鉴定、药敏试验和实时荧光定量PCR检测,对膜孔蛋白OprD2表达量降低的耐亚胺培南铜绿假单胞菌株进行基因序列检测。分析细菌鉴定、药敏试验结果和标本来源情况,比较耐药组与敏感组OprD2的mRNA表达量,分析耐亚胺培南铜绿假单胞菌的抗菌药敏感性结果、OprD2基因突变类型。结果90株亚胺培南耐药与敏感铜绿假单胞菌中,仪器法最低抑菌浓度≥8μg/ml、纸片抑菌圈≤15mm共45株,纳为耐药组;仪器法最低抑菌浓度≤2μg/ml、纸片抑菌圈≥19mm共45株,纳入敏感组。90株亚胺培南耐药与敏感铜绿假单胞菌主要分布于呼吸内科(40.00%)、神经内科(33.33%),标本类型主要为痰(41.11%)。耐药组铜绿假单胞菌OprD2基因的mRNA表达量为0.32(0.03,1.23),低于敏感组的0.70(0.06,2.68),差异有统计学意义(P<0.05)。耐亚胺培南铜绿假单胞菌株均对亚胺培南、哌拉西林完全耐药,对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、美罗培南耐药率较低,对阿米卡星、庆大霉素完全敏感,而无耐药性。45株耐亚胺培南株菌中,检出OprD2基因突变或缺失40株,占比88.89%;其中终止密码提前7株、非中断突变及PCR扩增阴性均5株、移码突变13株。结论OprD2基因突变或缺失,会导致膜孔蛋白OprD2表达量明显下降,促使铜绿假单胞菌对亚胺培南产生耐药。

耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶与膜孔蛋白carO、oprD基因研究

目的调查耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶与膜孔蛋白carO、oprD基因存在的状况,为临床资料提供参考依据。方法收集2008年1-12月医院住院患者痰液标本中分离的耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌共20株,用gyrA基因作分子鉴定,再用聚合酶链反应的方法分析13种A类β-内酰胺酶基因、10种B类β-内酰胺酶基因、2种C类β-内酰胺酶基因、8种D类β-内酰胺酶基因及膜孔蛋白carO和oprD基因。结果 20株耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌均检出A类β-内酰胺酶基因TEM-1型、C类β-内酰胺酶基因ADC-30型、D类β-内酰胺酶基因OXA-23型和OXA-66型;20株耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌的carO和oprD基因测得序列一致,但与鲍氏不动杆菌敏感(SDF)株相比均存在有义突变。结论耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌检出的TEM-1型、ADC-30型、OXA-23型和OXA-66型,carO和oprD基因突变是导致菌株对头孢类药物耐药的主要原因,耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌同时携带TEM-1型、ADC-30型、OXA-23型和OXA-66型基因和存在carO、oprD编码基因突变为国内首次报道。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌OprD_2基因缺失的研究

目的研究耐亚胺培南铜绿假单胞菌(PA)膜孔蛋白OprD2基因缺失情况。方法用琼脂稀释法测定PA对亚胺培南、美罗培南等10种常用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC);用聚合酶链反应(PCR)检测80株耐亚胺培南PA的OprD2基因。结果80株耐亚胺培南铜绿假单胞菌OprD2基因扩增44株阳性,经统计学分析,OprD2基因阳性组和阴性组对头孢他啶和氨曲南的耐药率有显著性差异(P<0.05)。结论OprD2基因缺失是PA对亚胺培南耐药的主要机制之一,且与头孢他啶和氨曲南的耐药性有一定关系。

医院感染耐亚胺培南铜绿假单胞菌与oprD2基因相关的ERIC分型研究

目的探究耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPA)的oprD2基因缺失在天津地区3所三甲医院内的分布以及该菌的克隆流行情况。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法检测60株IRPA的oprD2基因缺失情况,并以基于肠杆菌科基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)方法对其中的54株进行分子生物学分型。结果60株IRPA中有38株oprD2基因缺失,且3所医院的oprD2基因缺失率差异无统计学意义(P>0.05),54株IRPA用ERIC-PCR方法分为30型。结论IRPA的oprD2基因缺失在天津地区的分布差异无统计学意义,且提示尚有其他原因造成亚胺培南/西司他丁耐药株流行;个别科室内的IRPA存在克隆流行趋势,应注意监控IRPA在医院内的暴发流行。

铜绿假单胞菌耐亚胺培南相关基因OprD_2研究

目的研究铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。方法取临床分离的铜绿假单胞菌18株,经K-B法检测耐药性,根据耐药性分为耐亚胺培南菌组12株和敏感菌组6株。另设1标准菌株ATCC27853。采用PCR法检测各菌株的OprD2基因,探讨OprD2基因突变与细菌对亚胺培南耐药之间的关系。结果12株耐药菌经OprD2基因扩增,8株阴性,4株阳性;6株敏感菌株及标准菌株扩增全部为阳性。统计学检验结果表明,对亚胺培南耐药菌组和敏感菌组OprD2基因阳性率的差异有极显著性(P<0.01),且在耐药菌中发现了新的OprD2基因突变方式。结论OprD2突变是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制,突变的方式有缺失突变与插入失活。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶和oprD2基因的检测

目的:了解我院临床分离下呼吸道感染的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPA)oprD2基因和金属β-内酰胺酶(MBL)的分子流行病学情况。方法:铜绿假单胞菌的鉴定和药敏采用VITEK-2系统进行药物的最低抑菌浓度(MIC)检测。应用双纸片增效法和聚合酶链反应(PCR)方法检测其产MBL的表型及相关的oprD2基因、IMP型和VIM型金属酶基因。结果:157株亚胺培南铜绿假单胞菌对多种抗菌药物的耐药率均在40%以上,经双纸片增效法筛选出20株MBL阳性(12.7%),经PCR方法检测20株MBL阳性株中有13株IMP型基因阳性,oprD2基因有67株阳性,其余90株缺失(57.3%),未发现VIM型基因。有10株IRPA既携带IMP型基因同时又有oprD2基因缺失。结论:我院临床分离下呼吸道感染的耐亚胺培南铜绿假单胞菌呈较严重的多重耐药。IMP型基因是我院IRPA产MBL的主要基因型;oprD2基因缺失可能是铜绿假单胞菌亚胺培南耐药的重要原因之一。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性特征及oprD基因突变分析

为了分析亚胺培南耐药铜绿假单胞菌(IMPRPAE)临床分离株的耐药性及oprD基因变异情况,本研究收集了2014年1月至2017年12月临床标本中分离的35株IMPRPAE,采用VITEK2-compact系统分析IMPRPAE的耐药性;PCR法扩增基因oprD并测序分析其序列突变类型。IMPRPAE共15株,其中1株oprD基因PCR扩增阴性。余14株阳性菌株进行oprD基因测序发现其中1株无突变,11株有框码移位(其中有2株发现携带插入序列ISPpu21,IS1394),2株有终止密码子提前出现。本研究中铜绿假单胞菌oprD基因突变是亚胺培南耐药的主要原因。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌oprD2基因与金属酶的检测

目的研究oprD2基因与金属酶(MBL)在亚胺培南耐药机制中的作用。方法对天津地区3所综合医院临床分离60株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌,以2-巯基乙醇(2-MPA)为酶抑制剂,在MH平皿上用纸片扩散法进行抗生素协同敏感性检测,并用PCR检测MBL基因和oprD2基因。结果60株临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,IRPA)中,2-MPA方法筛选出15株(25%)MBL阳性;以PCR方法检测,22株(36.4%)oprD2基因阳性,19株(31.7%)产生IMP-1型MBL,未发现VIM-2与IMP-2酶,7株IRPA同时含有IMP-1和oprD2基因。结论IMP-1为天津地区IRPA产MBL的主要类型,也是临床分离铜绿假单胞菌亚胺培南耐药的重要原因之一。

铜绿假单胞菌产AmpC β-内酰胺酶及外膜孔蛋白OprD_2基因缺失分析

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌中产Amp Cβ-内酰胺酶(简称Amp C酶)及外膜孔蛋白Opr D_2基因缺失的情况。方法采用三维试验检测Amp C酶,聚合酶链反应(PCR)检测外膜孔蛋白Opr D_2基因和Amp C酶结构基因amp C,进行统计学分析。结果 63株铜绿假单胞菌中Amp C酶阳性14株(22.22%);Opr D_2基因阳性22株(Opr D_2基因缺失率65.08%);amp C基因阳性62株(93.94%)。铜绿假单胞菌对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢替坦、头孢曲松和头孢唑啉的耐药率达100.00%。产Amp C酶的菌株对亚胺培南、庆大霉素、头孢吡肟的耐药率分别为42.85%、64.29%和57.14%,不产Amp C酶的菌株分别为30.61%、6.12%和14.29%,二者对庆大霉素和头孢吡肟的耐药率差异均有统计学意义(P<0.01),对亚胺培南的耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。6株Opr D_2缺失合并产Amp C酶的铜绿假单胞菌对亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟的耐药率分别为100.00%、66.67%和55.56%,8株Opr D_2正常表达合并产Amp C酶的菌株分别为0.00%、25.00%和37.50%,二者差异有统计学意义(P<0.05)。结论铜绿假单胞菌多重耐药可能是由多种机制共同控制的,应加强铜绿假单胞菌产酶的监测及耐药基因的分子流行病学研究。

重庆某三甲医院2014-2016年铜绿假单胞菌耐药表型及金属酶、外膜孔蛋白耐药基因型分析

目的检测亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶基因分布和外膜孔蛋白OprD2基因缺失情况,了解铜绿假单胞菌的耐药状况。方法收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所2014-2016年临床分离的非重复铜绿假单胞菌1 887株,VITEK-MS质谱仪进行菌株鉴定,最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)法测定其对10种常用抗菌药物的敏感性,利用WHONET5.6软件对药敏资料进行统计分析,同时采用亚胺培南-EDTA纸片法筛选金属酶表型阳性的菌株,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)测铜绿假单胞菌金属β-内酰酶(metallo-β-lactamase,MBL)相关基因(IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、NDM)和外膜孔蛋白OprD2基因的情况。结果 3年中铜绿假单胞菌每年的分离数量分别为756株(9.4%)、579株(9.5%)和552株(10.7%),主要来自ICU病房和呼吸内科病房,标本类型以痰液为主;2014-2016年分离出的铜绿假单胞菌对妥布霉素、庆大霉素的耐药率逐年下降,其耐药率分别从2014年的11.3%、13.2%下降至2016年的7.8%、9.0%,对左旋氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率呈上升趋势,其耐药率从2014年的10.7%、9.2%上升至2016年的23.5%、11.6%。从基因型分布情况来看,269株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中MBL基因阳性51株(18.9%),外膜孔蛋白OprD2缺失158株(58.7%);51株产酶菌株中VIM型阳性29株,SPM型阳性22株,未检测出其他基因型。结论铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率较高;产MBL和外膜孔蛋白OprD2基因缺失是引起铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。

重症监护室耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌相关耐药基因的研究

目的研究重症监护室耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药机制。方法采用K-B法对44株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌进行药敏试验,采用PCR方法检测碳青霉烯酶金属酶(MBL)IMP、VIM、GIM、SPM和IMI耐药基因和外膜通道蛋白OprD2基因。结果对多黏菌素未出现耐药,对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、庆大霉素、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶和头孢吡肟耐药率分别为13.6%、50.0%、31.8%、25.0%、40.9%和50.0%,对左旋氧氟沙星和头孢噻肟的耐药率都接近90%,亚胺培南、美洛培南、氨苄西林、头孢唑啉、头孢西丁的耐药率均为100%。检出OprD2基因缺失21株(47.7%),IMP阳性6株(13.6%),VIM阳性3株(6.8%),未检出GIM、SPM和IMI耐药基因。结论耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌多重耐药情况严重。主要是由于外膜孔蛋白OprD2基因缺失和产金属酶IMP、VIM耐药基因引起。

铜绿假单胞菌的耐药性分析及相关耐药基因的检测

用ATB系统鉴定细菌,K-B法做药敏试验,筛选出15株产ESBLs的多重耐药菌株,用PCR法检测相关耐药基因TEM、OprD2。结果显示,我院铜绿假单胞菌(Pa)对12种抗菌药物的耐药率较高,71株Pa中32株产ESBLs,阳性率达45.1%;32株中全部耐药的有15株,占46.9%;15株产ESBLs的多重耐药菌株中,TEM基因阳性者9株,占60.0%;OprD2基因全部缺失。认为本院Pa耐药情况较为严重,TEM基因的表达和OprD2基因的缺失是我院Pa耐药的主要原因。

一株泛耐铜绿假单胞菌40种耐药相关基因的研究

目的研究一临床分离株泛耐铜绿假单胞菌40种耐药相关基因。方法应用法国梅里埃公司的API鉴定条／PSE5．0药敏条和美国BD公司的Phoenix NMIC／ID-109鉴定／药敏板鉴定和细菌药敏试验，应用PCR法检测1株泛耐铜绿假单胞菌临床分离株29种D-内酰胺酶相关基因、外膜蛋白D2基因（oprD2）、6种氨基糖甙类修饰酶基因（AMEs）、消毒剂／磺胺耐药基因（qacEΔ1-sul1）、3种整合子基因（intI1、2、3）等40种耐药相关基因，分析其分布情况。结果在本株菌，6种耐药相关基因阳性（二种β＊内酰胺酶基因（blaTEM、blaOXA10）、二种氨基糖甙类修饰酶基因（aac（6′）-Ⅱ、aac（3）-Ⅱ）、qacE△1-sul1和Ⅰ类整合子基因（intI1）），同时oprD2缺失；其它27种β-内酰胺酶基因、4种氨基糖甙类修饰酶基因（aac（6′）-Ⅰb、aac（3）-Ⅰ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ）和2种整合子基因（intI2、intI3）均为阴性。结论本株泛耐菌耐药机制为多重机制，主要与7种耐药相关基因（blaTEM、blaOXA10、oprD2缺失、aac（6′）-Ⅱ、aac（3）-Ⅱ、qacE△1-sul1和Ⅰ类整合子）有关。经检索中文生物医学期刊文献数据库（CMCC）和medline数据库，本研究是泛耐铜绿假单胞菌检测耐药相关基因最多的报道。