长波紫外线对人黑素瘤细胞中视蛋白3的表达及细胞增殖的影响

目的研究长波紫外线对人黑素瘤细胞中视蛋白3(OPN3)的表达及对细胞增殖的影响。方法利用不同剂量的UVA分别照射人黑素瘤细胞系(A375细胞和MV3细胞)后,通过5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)实验及细胞增殖与活性检测试剂(CCK-8)检测照射前后细胞的增殖情况,实时荧光定量(RT-qPCR)分别检测细胞中视蛋白(OPN)的mRNA表达水平;利用慢病毒技术分别沉默和过表达A375细胞和MV3细胞中的OPN3,采用EdU实验及CCK-8方法检测细胞的增殖水平;沉默A375细胞和MV3细胞中OPN3后进行UVA照射,通过EdU及CCK-8方法检测照射前后细胞增殖的变化;采用转录组测序技术检测过表达及沉默OPN3的MV3细胞中差异基因的表达,并进行KEGG富集相关信号通路分析,免疫印迹法(Western blot)验证Hippo信号通路相关蛋白的表达情况。结果与Control组相比,UVA照射组中的细胞增殖能力明显增强(P<0.05);RT-qPCR结果显示,OPN1、OPN2、OPN3、OPN4以及OPN5在A375和MV3细胞中均有表达,其中OPN3的转录表达水平水平均明显高于其他OPN(P<0.05);UVA照射组中A375和MV3细胞OPN3蛋白表达水平明显升高,沉默OPN3的表达后,A375和MV3细胞的增殖能力减弱,过表达OPN3后A375和MV3细胞的增殖能力增强(P<0.05);沉默人黑素瘤细胞(A375细胞和MV3细胞)OPN3后经UVA照射,细胞增殖能力较单纯照射UVA时降低(P<0.05);沉默及过表达MV3细胞中OPN3的表达后,RNA-seq测序结果筛选出141个差异基因,KEGG分析筛选差异基因富集信号通路9条,其中-Log10(FDR)值最高的为Hippo信号通路;沉默OPN3后,检测到LATS1表达水平增加,p-YAP、YAP、RhoA蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论UVA可促进人黑素瘤细胞系(A375细胞和MV3细胞)OPN3的表达,并通过Hippo信号通路调控细胞的增殖过程。

Opsin3糖基化位点的鉴定及糖基化修饰功能

为鉴定Opsin3(OPN3)的糖基化位点,通过使用衣霉素(tunicamycin)以及N-糖酰胺酶F(PNGase F)处理发现OPN3存在糖基化修饰;通过预测以及蛋白质氨基酸位点点突变鉴定OPN3的糖基化位点;利用SNAP标签蛋白构建了SNAP-Opsin3(SNAP-OPN3)重组蛋白,使用SNAP-OPN3重组蛋白进行糖基化修饰对OPN3功能影响的研究。在表达SNAP-OPN3重组蛋白后,使用SNAP-tag的反应底物SNAP-Surface;549以及SNAP-Cell;OregonGreen;通过荧光共聚焦显微镜观察OPN3以及OPN3糖基化位点突变体是否能够成熟转运至细胞膜。结果表明,OPN3的N82位点为OPN3的糖基化位点;SNAP标签不影响OPN3功能的正常发挥;使用SNAP反应底物可以清楚地观察到糖基化位点突变的OPN3不能正常转运至细胞膜。本研究首次鉴定了OPN3的糖基化位点,并构建了SNAP-OPN3重组蛋白,发现SNAP标签并不影响OPN3的成熟转运,并利用SNAP底物验证了糖基化修饰影响OPN3蛋白的成熟转运。

人结节型皮肤基底细胞癌病变组织和细胞株中视蛋白3的表达及功能

目的探讨人结节型皮肤基底细胞癌(BCC)病变组织及细胞株中视蛋白3(OPN3)的表达及功能。方法选取31例结节型BCC患者病灶组织及相邻癌旁正常组织(PANST)分别作为病灶组及PANST组,采用免疫荧光染色法检测OPN3的表达,Western blot及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测2组标本组织中OPN3蛋白及mRNA的表达;取对数生长期的人BCC细胞株TE354T,分为对照(Control)组、空白(RNAi-NC)组及实验(RNAi-OPN3)组,并设计针对人OPN3的小干扰RNA转染TE354T细胞,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测OPN3下调后0、24、48及72 h RNAi-NC组及RNAi-OPN3组的细胞增殖活性,采用Transwell迁移和细胞划痕实验检测OPN3下调48 h后2组细胞的迁移能力,采用流式细胞术和Western blot分别检测OPN3下调48 h后2组细胞凋亡数量及钙通道相关蛋白环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)、钙调蛋白依赖激酶Ⅱ(CAMKⅡ)、磷酸化CAMKⅡ(p-CAMKⅡ)的表达。结果与PANST组比较,病灶组BCC组织中OPN3表达增高(P<0.05);下调OPN3后72 h,RNAi-OPN3组TE354T细胞增殖活性较RNAi-NC组下降(P<0.05);下调OPN3后48 h,与RNAi-NC组相比,RNAi-OPN3组TE354T细胞迁移能力降低(P<0.05),TE354T细胞凋亡细胞数量增加(P<0.05),TE354T细胞钙通道相关蛋白p-CREB和p-CAMKⅡ表达下降(P<0.05)。结论OPN3在人结节型BCC组织中高表达,可调控人BCC系TE354T细胞的增殖、迁移及凋亡,其机制可能与钙依赖G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路有关。

视蛋白3调控人真皮成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白生成

目的研究视蛋白3在正常人真皮成纤维细胞中对Ⅰ型胶原蛋白生成的影响及其可能的机制。方法取小儿包皮真皮成纤维细胞分离、培养、传代,至3~5代,用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别检测视蛋白1~5的表达,细胞免疫荧光检测视蛋白3及Ⅰ型胶原蛋白表达及定位。设计针对人视蛋白3的小干扰RNA,利用脂质体转染入正常人真皮成纤维细胞,分别用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹检验视蛋白3抑制效率。成功下调视蛋白3后,用荧光定量PCR、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定及细胞免疫荧光检测Ⅰ型胶原蛋白表达变化;通过CCK-8及EDU检测细胞增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期,Transwell检测细胞迁移能力;通过蛋白免疫印迹法检测PI3K、AKT及磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT的表达情况。最后抑制通道蛋白AKT的磷酸化,通过蛋白免疫印迹法检测Ⅰ型胶原蛋白表达变化。结果视蛋白1~5均在正常人真皮成纤维细胞中表达,其中视蛋白3基因及蛋白表达水平较其他视蛋白表达高,差异有统计学意义(P<0.05)。下调正常人真皮成纤维细胞中视蛋白3后,细胞合成及分泌Ⅰ型胶原蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);细胞增殖、迁移能力减弱,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期中S期比例明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平被明显抑制;抑制通路蛋白AKT的活化后,细胞合成Ⅰ型胶原蛋白水平降低。结论视蛋白3参与调控正常人真皮成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白的合成,可能是创伤愈合、纤维化相关疾病及医疗美容潜在的治疗靶点。

视蛋白3通过VEGFR-2调节人皮肤微血管内皮细胞的血管生成

目的探讨视蛋白在人皮肤微血管内皮细胞中的表达,及其对皮肤微血管内皮细胞的增殖、迁移及小管形成的影响。方法通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别验证视蛋白的基因表达水平和蛋白表达水平。然后使用小干扰RNA技术沉默视蛋白3,分别用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法验证视蛋白3的沉默效率。小干扰RNA成功沉默视蛋白3后,通过CCK-8法检测细胞的增殖活力,Transwell检测细胞的迁移能力,小管形成实验评估血管形成能力的情况。最后通过蛋白印迹法检测信号通路相关蛋白的表达情况。结果视蛋白1~5均在血管内皮细胞中表达,其中视蛋白3基因表达水平较其他视蛋白表达高,差异有统计学意义(P<0.05);沉默人皮肤微血管内皮细胞中视蛋白3后,细胞的增殖、迁移、小管形成能力均减弱,差异有统计学意义(P<0.05),血管生成的关键蛋白血管内皮生长因子受体2、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶1/2、内皮型一氧化氮合酶的表达均降低。结论视蛋白3在人皮肤微血管内皮细胞中高表达,并调控血管形成,可能成为血管生成相关疾病的一个潜在治疗靶点。