stim1和orai1蛋白在哮喘大鼠支气管平滑肌中的表达

目的研究基质交感分子1(stim1)和钙离子释放激活钙离子通道蛋白1(orai1)在哮喘气道平滑肌细胞中表达水平的变化。方法选取40只清洁级SD大鼠随机分为对照组和哮喘组,其中哮喘组用鸡卵清蛋白(OVA)激发制备大鼠哮喘模型(n=20),对照组用生理盐水代替(n=20)。肺组织病理切片HE染色判断哮喘模型是否建立成功,分析支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数及分类计数,应用免疫组化技术及彩色病理图文分析系统测定stim1和orai1蛋白阳性细胞平均光密度值。结果肺组织病理切片HE染色镜下观察呈现大量炎细胞浸润,支气管黏膜肿胀,支气管腔内可见黏液栓等,证实哮喘模型建立成功。哮喘组中大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。哮喘组大鼠支气管平滑肌表达orai1蛋白阳性细胞平均光密度值明显高于对照组(P<0.05)。哮喘组和对照组大鼠支气管平滑肌表达stim1蛋白阳性细胞的平均光密度值无明显差异(P>0.05)。结论 orai1蛋白在哮喘大鼠气道平滑肌细胞中表达变化较stim1蛋白明显,对支气管平滑肌调节作用可能更重要。

Orai1蛋白体外干预对小鼠nuocyte细胞功能的影响

目的探讨nuocyte细胞是否表达Orai1蛋白及该蛋白的功能。方法用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)建立小鼠变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)模型,计数AR小鼠的打喷嚏、挠鼻次数,分离、提纯并体外培养AR小鼠鼻相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)中的nuocyte细胞,用激光扫描共聚焦显微镜定性检测该细胞Orai1蛋白的表达,以ELISA法和实时荧光定量RT-PCR法分别定量检测该细胞Orai1蛋白及其mRNA的表达量,将小鼠重组(recombinant,rm)白介素(interleukin,IL)-33加入nuocyte细胞培养基,检测其中IL-5和IL-13蛋白及其mRNA的浓度,然后再将Orai1蛋白抗体加入nuocyte细胞培养基,再次检测其中IL-5和IL-13蛋白及其mRNA的含量。结果小鼠AR模型打喷嚏和挠鼻次数较正常小鼠显著增多,OVA诱导NALT来源的小鼠nuocyte细胞被鉴定为CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcεR1(lineage)-ICOS+,该细胞表面表达Orai1蛋白,其蛋白和mRNA含量均较正常小鼠显著升高,rmIL-33加入nuocyte细胞培养基后,IL-5和IL-13蛋白及其mRNA的浓度均明显增多,而加入Orai1蛋白抗体后,其浓度出现下降。结论 nuocyte细胞表达Orai1蛋白,该蛋白的干预抑制nuocyte细胞的正常功能。

HBx蛋白与细胞膜钙离子通道蛋白Orai1的关系

目的:研究乙型肝炎病毒x基因(hepatitis B virus x gene,HBx)蛋白调节细胞内钙离子可能分子机制,揭示乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)诱导肝癌的可能途径.方法:培养HEK293细胞,取第2代HEK293细胞转染pcDNA-HBx质粒,培养12、24和48 h后,细胞活力细胞毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)观察转染后细胞生长情况,Western b l o t检测H B x蛋白的表达情况,当共同转染HBx基因、Orai1基因或STIM1基因后co-IP实验、免疫荧光检测观察细胞内蛋白结合情况.结果:转染pcDNA-HBx质粒后HBx蛋白可以在HEK293细胞高表达,转染后的24 h后细胞增殖加快(P<0.05),co-IP实验及免疫荧光检测结果均显示,HBx蛋白在细胞内可以与Orai1蛋白结合.结论:HBx蛋白通过与细胞膜钙离子通道Orai1结合,来升高细胞内钙离子浓度,从而影响细胞增殖等活性.

结肠腺癌中Orai1与STIM1的表达及临床意义

目的探讨Orai1和STIM1蛋白在结肠腺癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化法检测80例结肠腺癌及50例正常结肠黏膜中Orai1和STIM1蛋白的表达。分析两者表达与结肠腺癌临床病理特征及预后的关系。结果结肠腺癌组织中Orai1和STIM1表达水平均显著高于正常结肠黏膜(P均<0.05);Orai1和STIM1表达与肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05),与患者性别、年龄、分化程度无关(P>0.05)。结肠腺癌中Orai1与STIM1蛋白表达呈正相关(P=0.001,rs=0.349)。单因素生存分析显示,Orai1蛋白、STIM1蛋白、TNM分期及淋巴结转移与结肠腺癌患者预后相关(P<0.05)。结论 Orai1和STIM1可能具有协同作用,共同促进结肠癌的发展,有望成为结肠癌诊断、治疗以及判断预后的生物学指标。

乙型肝炎病毒X蛋白升高细胞内钙离子机制研究

目的研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)调节细胞内钙离子可能的分子机制,揭示乙型肝炎病毒(HBV)诱导肝癌的可能途径。方法培养人胚肾细胞(HEK293),取第2代HEK293细胞共转染HBx基因、钙释放激活钙通道蛋白1(Orai1)基因或者间质相互作用因子1(STIM1)基因,免疫共沉淀(co-IP)实验观察细胞内蛋白结合情况,并使用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)pull-down实验研究HBx与Orai1作用位点,使用钙离子测量/成像系统检测HBx蛋白对细胞内钙离子的影响。结果转染后细胞生长状态良好,co-IP实验结果显示HBx蛋白在细胞内可以与Orai1蛋白结合,GST pull-down实验显示HBx蛋白可以与Orai1蛋白C末端结合,钙离子测量/成像系统检测显示HBx蛋白可升高活细胞钙内流。结论 HBx蛋白通过与细胞膜钙离子通道Oria1结合蛋白的C末端结合,增加细胞钙内流,扰乱细胞内钙离子平衡,从而影响细胞增殖等活性。

钙库调控的钙通道Orai1体外研究方法的建立

目的：建立钙通道Orai1的体外研究方法。方法：利用脂质体重组技术,将体外纯化的Orai1蛋白重组到脂质体膜上,利用蔗糖密度梯度离心来检测其重组效率及Orai1蛋白在脂质体膜上的结构,并利用钙染料Fura-2检测脂质体内钙离子的释放。结果：成功制备了脂质体及体外纯化了GST-Orai1融合蛋白,蔗糖密度梯度离心结果证明GST-Orai1蛋白成功重组到脂质体上,以及Orai1蛋白以多聚体的形式定位在脂质体膜上。钙离子释放实验证明脂质体内钙离子包装完好,可用于后续Orai1钙通道的功能研究。结论：利用脂质体重组技术建立了一种新的Orai1的研究方法,能够更直接有效地研究其功能及其活化机制。

钙释放激活钙离子通道的发现及研究现状

Ca2+释放激活Ca2+(CRAC)通道是位于非兴奋性细胞质膜上的慢Ca2+通道,是非兴奋性细胞(尤其T淋巴细胞和HEK 293细胞)中胞外Ca2+进入细胞内的主要途径.Ca2+内流是T淋巴细胞激活的最重要的生理生化特征之一.Orai1蛋白单体是组成CRAC通道的亚基,4个Orai1蛋白亚基构成一个四聚体CRAC通道.内质网Ca2+浓度的降低使得STIM1发生定向运动并产生聚集,从而激活了CRAC通道.STIM1蛋白把内质网Ca2+的损耗与CRAC通道上的Ca2+内流联系起来,行使了Ca2+浓度感受器的功能.

粉防己碱通过调控SOCE通路对L-精氨酸诱发的小鼠重症急性胰腺炎的防治作用

目的观察粉防己碱(Tetrandrine,Tet)对L-精氨酸(L-arginine)诱发的重症急性胰腺炎(SAP)小鼠胰腺组织钙库操纵的Ca2+通道(SOCE)的关键效应蛋白基质相互作用分子1(STIM1)及钙释放激活钙通道蛋白1(ORAI1)表达的影响,探讨粉防己碱防治重症急性胰腺炎的作用机制。方法将健康昆明小鼠40只随机分为4组:对照组、重症急性胰腺炎模型组、粉防己碱高剂量组及粉防己碱低剂量组,每组10只。除对照组外,其余小鼠均给予腹腔注射20%L-精氨酸复制重症急性胰腺炎模型(3.5 g·kg^(-1),共2次,间隔1 h),在模型复制4 h后粉防己碱治疗组给予腹腔注射粉防己碱高、低剂量治疗(120、60 mg·kg^(-1),每日2次,共3 d)。于模型复制72 h后麻醉动物,收集血清,检测血清淀粉酶水平;完整摘取小鼠胰腺及肺组织,胰腺称质量并计算胰腺脏体比;HE染色观察各组小鼠胰腺及肺组织形态学改变;免疫组化法观察胰腺组织STIM1及ORAI1的阳染表达;Western Blot法检测胰腺组织STIM1及ORAI1蛋白的表达;RT-qPCR法检测胰腺组织STIM1及ORAI1 mRNA的表达。结果与对照组比较,重症急性胰腺炎模型组小鼠血清淀粉酶及胰腺脏体比均明显增加(P<0.01);胰腺组织出现明显水肿,腺泡细胞大面积坏死伴胰腺间质出血及大量炎症细胞浸润,肺组织可见肺泡间隔明显水肿、增宽,并伴大量炎症细胞浸润及充血;胰腺组织STIM1及ORAI1的蛋白和mRNA表达水平均明显增高(P<0.01)。与重症急性胰腺炎模型组比较,粉防己碱高、低剂量组小鼠血清淀粉酶及胰腺脏体比明显降低,胰腺及肺组织损伤程度减轻,胰腺组织水肿、出血及坏死程度明显减轻,炎性细胞浸润减少,胰腺组织STIM1及ORAI1的蛋白和mRNA表达水平均明显降低(P<0.01)。结论重症急性胰腺炎小鼠胰腺组织SOCE信号通路活化,参与重症急性胰腺炎的病程进展;粉防己碱可通过抑制SOCE信号通路活化,进而减轻重症急性胰腺炎胰腺损伤程度。