外侧下丘脑orexin能神经元区微注射腺苷对大鼠睡眠-觉醒周期的影响

目的探讨外侧下丘脑orexin能神经元区微注射腺苷对SD大鼠睡眠-觉醒周期的影响。方法选用成年雄性SD大鼠14只,按3种不同的给药模式在外侧下丘脑orexin能神经元区分别微注射1、10、20 nmol/μl腺苷,以人工脑脊液为自身对照,然后采用脑电机同步记录大鼠的脑电和肌电活动,观察外侧下丘脑区微注射腺苷后大鼠睡眠-觉醒周期的变化。结果与人工脑脊液自身对照相比,在大鼠外侧下丘脑分别微注射1、10 nmol/μl和20 nmol/μl腺苷后的3 h内,大鼠觉醒时间明显减少到人工脑脊液自身对照的84%、62%和60%,并且大鼠睡眠时间均有不同程度的延长(P<0.05)。在微注射20 nmol/μl腺苷后,大鼠觉醒时间持续减少了3 h,并且与微注射1、10 nmol/μl腺苷后相比,其觉醒时间的减少和NREM/REM睡眠时间的增加也最明显。结论在外侧下丘脑orexin能神经元区微注射腺苷促进大鼠睡眠。

黄芩素可缓解蛛网膜下腔出血后神经元的铁死亡

背景:铁死亡是一种区别于凋亡、坏死等新型细胞程序性死亡的方式,主要由累积的脂质过氧化引起,已被证实参与蛛网膜下腔出血后的病理过程。黄芩素是一种铁螯合剂,能够抑制脂质过氧化反应,但其在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中缓解神经元铁死亡的作用仍未明确。目的:探讨黄芩素治疗蛛网膜下腔出血后对神经元铁死亡的影响及机制。方法:提取孕16-17 d C57BL/6L胎鼠大脑皮质神经元细胞,运用血红蛋白刺激原代神经元模拟体外蛛网膜下腔出血模型。采用CCK-8法检测5,15,25,50,100μmol/L黄芩素作用24 h后原代神经元细胞的活力,确定黄芩素的最适浓度。然后将原代神经元细胞分为对照组、血红蛋白组、血红蛋白+黄芩素组,利用试剂盒检测细胞内活性氧和丙二醛水平,RT-PCR检测铁死亡相关标记物PTGS2、SLC7A11、谷胱甘肽过氧化物酶4的mRNA表达;进一步将原代神经元细胞分为对照组、SLC7A11抑制剂Erastin组、血红蛋白组、血红蛋白+黄芩素组、血红蛋白+黄芩素+Erastin组,Western blot检测铁死亡相关标记物SLC7A11和谷胱甘肽过氧化物酶4的蛋白表达。结果与结论:(1)选取25μmol/L黄芩素作为后续实验浓度;(2)与血红蛋白组相比,血红蛋白+黄芩素组丙二醛和活性氧水平显著下降(P <0.05);(3)与血红蛋白组相比,血红蛋白+黄芩素组PTGS2的m RNA表达显著下降,SLC7A11和谷胱甘肽过氧化物酶4的m RNA表达显著升高(P <0.000 1);(4)SLC7A11抑制剂Erastin能在一定程度上逆转黄芩素改善的铁死亡作用(P <0.05);(5)结果表明,黄芩素可通过SLC7A11/GPX4通路缓解蛛网膜下腔出血后神经元细胞的铁死亡。

创伤性脑损伤大鼠皮质神经元中Lnx1表达及参与继发性脑损伤的机制

背景:细胞凋亡在继发性脑损伤中发挥重要作用。探究创伤性脑损伤后促进神经细胞存活的病理生理机制,将为防治创伤性脑损伤提供新的方向和理论依据。目的:探究Lnx1分子在哺乳动物脑损伤后皮质神经元中的表达变化及参与继发性脑损伤的可能机制。方法:80只成年SD大鼠平均分成假手术组和创伤性脑损伤组,每组雌雄各20只。采用重物坠落方法建立创伤性脑损伤大鼠模型,分别在脑损伤后6,12,24,48,72 h,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光染色等技术分析相关分子在受损皮质神经元中的表达情况。结果与结论:(1)创伤性脑损伤组大鼠损伤部位脑组织出血,可观察到明显的组织损伤,脑组织含水量升高;(2)与假手术组相比,创伤性脑损伤组皮质神经元中Lnx1表达在损伤24 h开始显著升高;(3)创伤性脑损伤后与Lnx1相结合的PBK和BCR蛋白表达降低,促存活因子ctgf的表达升高;(4)结果表明:脑损伤后神经元中Lnx1表达上调,其通过降低靶分子PBK和BCR的表达,进一步上调促成活因子ctgf的表达,对受损神经元具有保护作用。

Orexin-A和RJR-2403影响脊髓腹角神经元自发动作电位的比较

目的:探究食欲素-A(orexin-A)和α_(4)β_(2)-N型乙酰胆碱受体(α_(4)β_(2)-nAChR)选择性激动剂RJR-2403分别对新生大鼠离体脊髓腹角神经元自发动作电位影响的差异。方法:应用8~12 d新生SD大鼠,麻醉后游离出颈端至骶部的脊髓,保留腰骶膨大节段并制备切片。切片孵育30min,采用木瓜蛋白酶消化19~22 min,转常温孵育45~60 min。沿中央管切取脊髓腹角,使用口径从大到小的巴斯德吸管急性机械分离神经元,静置20 min待细胞贴壁,在倒置显微镜下利用膜片钳记录良好的神经元,联合药理学方法进行功能性研究。在电流钳记录模式下,观察orexin-A和RJR-2403分别对离体脊髓腹角神经元自发放电(动作电位)的影响,并比较多种参数的差异。结果:(1)本研究应用急性分离的脊髓腹角神经元进行膜片钳记录,所记录的神经元胞体完整,形态多样,能发出较多突起且有分支;(2)给予orexin-A前的腹角神经元自发动作电位的频率[(3.55±0.66)Hz]低于给药后[(8.26±3.31)Hz](P<0.01),给药前动作电位幅值[(95.28±7.21)mV]高于给药后[(85.15±5.80)mV](P<0.05),静息电位和动作电位半幅时程无明显变化;(3)应用RJR-2403前,腹角神经元的静息电位[(-66.67±43.38)mV]高于给药后[(-60.48±3.38)mV](P<0.01),给药前放电频率[(2.74±1.60)Hz]低于给药后[(8.94±3.14)Hz](P<0.001),给药前动作电位幅值[(84.96±4.85)mV]高于给药后[(73.77±5.42)mV](P<0.01),给药前半幅时程[(4.34±1.52)ms]低于给药后[(5.39±1.80)ms](P<0.01)。结论:Orexin-A和RJR-2403对脊髓腹角神经元自发动作电位均具有正性调制作用,但对于静息电位、半幅时程存在不同作用,可能源于促代谢型受体和促离子型受体介导的作用差异。

SD大鼠乳鼠原代皮质神经元和小胶质细胞同时提取并培养的实验方法

背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取。因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键。目的:探索一种新型同时提取原代皮质神经元及小胶质细胞的方法。方法:取24 h内新生SD大鼠乳鼠,将大脑取出放入装有DMEM的培养皿中,去除软脑膜后备用。同一脑组织,先提取原代神经元,再将剩余脑组织用于提取小胶质细胞,整个过程在冰上操作。原代皮质神经元提取培养步骤:镊子夹取2.0-3.0 mm厚度大脑皮质组织置于培养皿,用木瓜蛋白酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈互相粘连的组织悬液,吸上清细胞悬液,过滤、分装到15 mL离心管中,离心并重悬后将细胞接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板爬片上放入细胞培养箱,每隔1 d观察神经元形态,第7天进行MAP2和β-Tubulin免疫荧光染色鉴定。小胶质细胞提取培养步骤:夹取上一步取皮质后剩余脑组织,厚度8-10 mm,置于培养皿,用胰酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈匀浆,然后将匀浆转移到培养瓶中培养,第14天将培养瓶封口后进行恒温水平摇床振荡2 h,小胶质细胞脱落于上清中;取纯化后的小胶质细胞继续培养3 d进行Iba1免疫荧光染色鉴定。结果与结论:(1)神经元培养24 h后贴壁、胞体变大,部分神经元长出突触;培养到第3,5天时胞体进一步增大,大部分神经元已呈突触形态,部分神经元成团生长;第7天时,神经元突触延长增粗并互相连接成网。经β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色鉴定为神经元。(2)小胶质细胞培养第1天换液后可见细胞贴壁生长;第3,5,7天时细胞密度均较小,细胞形态呈高亮椭圆或圆形,但已基本成团块状生长于其他细胞上层;第10天时小胶质细胞密度明显增大;第14天时小胶质细胞呈致密团块状生长于其他细胞上层,此时可进行分离纯化。取分离纯化后细胞再培养至第3天,经Iba1免疫荧光鉴定为小胶质细胞,且纯度大于95%。(3)结果表明,经此法提取并培养获得的原代皮质神经元和小胶质细胞纯度高、形态好、成活率高。

羟基红花黄色素A抑制糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡的作用

背景:羟基红花黄色素A具有抗缺血、抗氧化、抗血栓及抗炎等作用,其是否影响糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡,目前尚不清楚。目的:探讨羟基红花黄色素A对神经元焦亡的干预作用及机制。方法:取对数生长期的HT22细胞,随机分为5组:正常组、模型组、羟基红花黄色素A组、Colivelin组、Colivelin+羟基红花黄色素A组。利用糖氧剥夺/复糖复氧处理HT22细胞建立神经元焦亡模型,然后给予STAT3激动剂Colivelin、羟基红花黄色素A干预。干预后JC-1探针检测线粒体膜电位变化,活性氧试剂盒检测细胞内活性氧含量,GSDMD/TUNEL染色观察细胞焦亡情况,免疫荧光检测STAT3、GSDMD蛋白表达,RT-PCR检测STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达,Western blot检测p-STAT3、NLRP3、GSDMD、Cleaved-caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达。结果与结论:①与正常组相比,模型组焦亡细胞数量增多,p-STAT3、NLRP3、Cleaved-caspase-1、GSDMD、白细胞介素1β蛋白表达显著升高;与模型组相比,羟基红花黄色素A组焦亡细胞数量减少,焦亡相关蛋白的表达显著降低;②与模型组相比,Colivelin组细胞焦亡加剧,线粒体膜电位降低,活性氧含量增加,STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达升高,p-STAT3、NLRP3、GSDMD、Cleaved-caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达升高;与Colivelin组相比,Colivelin+羟基红花黄色素A组上述指标均有好转。结果表明:羟基红花黄色素A通过STAT3信号通路抑制糖氧剥夺/复糖复氧后HT22细胞焦亡发挥神经保护作用。

外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡促进神经元轴突的伸长

背景:神经元轴突损伤可致神经功能障碍,促进轴突伸长有望在神经系统疾病治疗中发挥重要作用。目的:探究外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡(ectomesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles,EMSC-EVs)能否促进神经元轴突伸长。方法:(1)组织贴壁法获取鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞,免疫荧光鉴定特异性标志物;超速离心法获取EMSC-EVs并进行鉴定;(2)EMSC-EVs(0,0.5,1.0,1.5 mg/mL)与PC12细胞共孵育72 h,CCK-8分析EMSC-EVs对PC12细胞的细胞毒性及增殖作用;(3)EMSC-EVs(1.0 mg/mL)与PC12细胞或神经元共孵育72 h,显微镜下观察轴突长度变化,实时荧光定量PCR及Western blot分析轴突相关标志物微管蛋白β3(早期)、生长相关蛋白43(中期)和神经丝蛋白200(成熟)表达变化,以探究EMSC-EVs是否能够促进PC12细胞或神经元轴突伸长。结果与结论:(1)所获取外胚层间充质干细胞大部分呈长梭形,少数呈不规则形,高表达间充质干细胞特异性标记物Nestin、CD44及Vimentin;所获取EMSC-EVs符合细胞外囊泡的生物学标准;(2)在0.5-1.5 mg/mL质量浓度范围内,EMSC-EVs促进PC12细胞增殖,且随浓度增加而增强;(3)EMSC-EVs促进PC12细胞及神经元轴突长度增加,促进轴突相关标志物微管蛋白β3、生长相关蛋白43和神经丝蛋白200的表达。这些结果说明,EMSC-EVs能够促进神经元轴突伸长。

通脉开窍丸治疗血管性痴呆模型大鼠海马区神经元的铁死亡变化

背景:研究表明铁死亡与血管性痴呆存在密切联系,通脉开窍丸对于改善血管性痴呆患者的认知功能有一定疗效,但其作用机制不明确。目的:基于核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)信号通路调控铁死亡探讨通脉开窍丸对血管性痴呆干预作用以及分子机制。方法:84只雄性SD大鼠,其中12只大鼠用作假手术组,其余大鼠用改良2-VO法制备成血管性痴呆的模型,成模后随机分为模型组、通脉开窍丸高、中、低剂量(27.6,13.8,6.9 g/kg)组、联合组[通脉开窍丸高剂量+ML385(20 mg/kg)]、盐酸多奈哌齐组(0.45 mg/kg),灌胃给药1次/d,联合组同时腹腔注射Nrf2抑制剂ML385,1次/d,连续4周。采用Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力;苏木精-伊红染色观察各组大鼠海马组织中神经元病理学变化;比色法试剂盒检测大鼠血清中还原型谷胱甘肽、Fe^(2+)、丙二醛的浓度;普鲁士蓝染色法检测大鼠海马组织中铁沉积情况;透射电镜观察大鼠海马组织中神经元线粒体超微结构变化;蛋白免疫印迹法检测大鼠海马神经元Nrf2、HO-1、GPX4、XCT、铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)蛋白的表达。结果与结论:(1)与假手术相比,模型组大鼠逃避潜伏期时间明显延长(P<0.05),穿越平台次数明显减少(P<0.05);海马组织松散,神经元细胞核深染,染色质固缩甚至裂解;CA1区铁离子聚集;线粒体萎缩变小,线粒体嵴溶解消失,线粒体膜密度增厚;血清中Fe^(2+)、丙二醛水平上升,还原型谷胱甘肽水平下降(P<0.05);海马组织GPX4、HO-1、XCT、Nrf2、FTH1蛋白表达显著降低(P<0.05)。(2)与模型组相比,通脉开窍丸各剂量组和盐酸多奈哌齐组大鼠平均逃避潜伏期均明显缩短(P<0.05),穿越平台次数增加(P<0.05);海马神经元恢复明显,CA1区神经元铁离子聚集明显减少,线粒体结构和功能好转;血清Fe^(2+)、丙二醛水平显著降低(P<0.05),血清还原型谷胱甘肽浓度及海马组织中GPX4,HO-1,XCT,Nrf2,FTH1蛋白表达显著升高(P<0.05)。(3)与通脉开窍丸高剂量组相比,盐酸多奈哌齐组治疗效果差异无显著性意义(P>0.05),联合组大鼠水迷宫逃避潜伏期时间延长(P<0.05),穿越平台次数减少(P<0.05),大鼠CA1区神经元病理改变情况不明显,铁沉淀增加,血清中丙二醛、Fe^(2+)浓度增加(P<0.05),还原型谷胱甘肽浓度减少(P<0.05),海马组织神经元线粒体萎缩变小,且Nrf2、XCT、HO-1、GPX4、FTH1蛋白的表达减少(P<0.05)。在一定范围内,通脉开窍丸剂量越高效果越好,且高剂量治疗效果不亚于盐酸多奈哌齐。(4)结果说明,通脉开窍丸可以减轻大鼠海马组织神经元病理改变,改善血管性痴呆大鼠的认知功能,其作用机制可能与Nrf2/HO-1/GPX4信号通路的激活抑制铁死亡有关。

曲克芦丁调控核因子κB信号通路抑制脑梗死模型大鼠脑损伤及神经元凋亡

背景:目前已有研究发现曲克芦丁对脑部疾病有明显的改善作用,但是关于曲克芦丁对脑梗死治疗及神经元细胞影响的研究较少。目的:探究曲克芦丁调控核因子κB信号通路对脑梗死大鼠脑损伤及神经元凋亡的作用机制。方法:选取清洁级大鼠50只,将其随机分为健康组、模型组、曲克芦丁+核因子κB激动剂组、曲克芦丁组、核因子κB抑制剂组,后4组均采用动脉结扎法建立脑梗死大鼠模型。健康组及模型组采用等量生理盐水灌胃处理,曲克芦丁+核因子κB激动剂组采用72 mg/kg曲克芦丁灌胃+20 mg/kg RANK腹腔注射干预,曲克芦丁组采用72 mg/kg曲克芦丁灌胃处理,核因子κB抑制剂组采用120 mg/kg核因子κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷进行腹腔注射,各组给药均1次/d,均连续干预30 d。药物干预完成后24 h,采用Zea-longa检测大鼠神经功能损伤,苏木精-伊红染色观察脑组织病理改变,TUNEL法检测神经元凋亡,采用免疫印迹法及PCR检测核因子κB p65、核因子κB p50蛋白及mRNA表达水平。结果与结论:①与健康组比较,模型组大鼠神经功能评分、神经元凋亡率、核因子κB p65、核因子κB p50 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05);②与模型组比较,曲克芦丁+核因子κB激动剂组神经功能评分、神经元凋亡率、核因子κB p65、核因子κB p50 mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05);③与曲克芦丁+核因子κB激动剂组比较,曲克芦丁组、核因子κB抑制剂组神经功能评分、神经元凋亡率、核因子κB p65、核因子κB p50 mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05),且曲克芦丁组与核因子κB抑制剂组比较无差异(P>0.05);④模型组大鼠脑组织有大量神经元细胞胞质空泡化,明显水肿和坏死现象及大量炎性细胞浸润现象;曲克芦丁+核因子κB激动剂组脑组织肿胀减轻,网状结构和固缩细胞减少,仍伴有部分水肿;曲克芦丁组及核因子κB抑制剂组脑组织肿胀和神经元水肿变性、细胞胞质空泡化及神经元细胞核固缩减少,炎症细胞浸润明显降低;⑤提示曲克芦丁能够降低脑梗死大鼠神经功能损伤表达、抑制神经元凋亡及改善其脑组织病理损伤,其作用机制可能与调控核因子κB及相关信号通路的表达相关。

血红素氧合酶1促进氧化应激条件下神经干细胞向神经元分化

背景:研究表明,血红素氧合酶1能增强细胞的抗氧化、抗凋亡能力,但血红素氧合酶1过表达对氧化应激条件下神经干细胞增殖和分化的影响尚不清楚。目的:探讨血红素氧合酶1过表达对氧化应激条件下神经干细胞存活和分化能力的影响。方法:(1)从新生Balb/c小鼠脊髓组织中分离培养小鼠原代神经干细胞,免疫荧光检测神经干细胞标志物Nestin的表达;(2)采用慢病毒感染神经干细胞以诱导血红素氧合酶1过表达,流式检测绿色荧光蛋白荧光强度,Western blot检测血红素氧合酶1的表达水平;(3)在慢病毒感染神经干细胞培养基中添加H_2O_2以模拟脊髓损伤后的氧化应激微环境,采用细胞增殖检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒和TUNEL染色试剂盒分析血红素氧合酶1过表达对神经干细胞增殖和凋亡水平的影响;(4)采用试剂盒检测脂质氧化标志物丙二醛、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平;(5)采用流式检测细胞内的活性氧水平以及神经干细胞向星形胶质细胞和神经元分化情况;(6)光学和荧光显微镜观察血红素氧合酶1过表达对神经干细胞分化的神经元轴突生长的影响。结果与结论:(1)小鼠神经干细胞球形态稳定,生长状态良好,免疫荧光检测Nestin呈阳性;(2)Western blot检测发现血红素氧合酶1过表达组神经干细胞中血红素氧合酶1的表达显著高于空载体对照组;流式检测血红素氧合酶1过表达组和空载体对照组神经干细胞均表达绿色荧光蛋白;(3)血红素氧合酶1过表达维持了神经干细胞在氧化应激条件下的增殖活力并显著减少了细胞凋亡数量;(4)血红素氧合酶1过表达抑制了氧化应激微环境下神经干细胞的脂质过氧化,增强了维持氧化-还原稳态的相关酶类表达,降低了细胞内的活性氧水平;(5)血红素氧合酶1过表达促进了神经干细胞向神经元分化,并抑制了向星形胶质细胞分化;(6)血红素氧合酶1过表达组的神经元轴突更长并且细胞间的连接更多。上述结果表明过表达血红素氧合酶1能减轻H_2O_2诱导的神经干细胞氧化损伤,抑制神经干细胞凋亡,促进神经干细胞增殖及向神经元细胞分化。

成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定

背景:课题组前期成功在体外分离培养乳鼠触液神经元,尚无研究报道有效分离培养高纯度成年小鼠触液神经元的方法,且触液神经元的自我更新能力是否随着年龄发生变化尚无研究。目的:建立一种高纯度成年小鼠触液神经元体外分离培养的方法,并鉴定成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元在体外的自我更新能力。方法:从成年3月龄小鼠颈髓分离含有触液神经元的原代细胞贴壁培养并利用融合多模态成像基因的慢病毒转染细胞,通过嘌呤霉素筛选得到高纯度成年小鼠触液神经元细胞,在完全培养基中悬浮培养。通过免疫荧光检测成年小鼠触液神经元表达神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)及SOX2情况,观察成年小鼠触液神经元体外成球与传代能力;将同等数量(5×10^(3))的第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元在同等条件下分为2组,分别接种在含有完全培养基的超低黏附培养板中,在体积分数5%CO_(2),37℃恒温箱悬浮培养,通过体外成球、CCK8实验、qPCR和Western blot鉴定成年小鼠及乳鼠触液神经元的自我更新能力。结果与结论:①实验成功在成年小鼠体内分离出高纯度触液神经元,在体外表达Nestin及SOX2,能形成神经球并连续传代。②成年小鼠触液神经元体外自我更新能力较乳鼠相比明显减弱,细胞培养到第4天时乳鼠触液神经元已经形成直径约为150μm的神经球,而成年小鼠触液神经元所形成的神经球直径仅为40μm(P<0.0001)。③CCK8增殖实验结果表明,成年小鼠触液神经元的增殖活性在培养后各时间点显著弱于乳鼠(P<0.0001)。④qPCR和Western blot检测发现成年小鼠触液神经元Nestin及SOX2的mRNA(P<0.0001)和蛋白表达量(P<0.01)较乳鼠显著下降。⑤上述结果证实,成年小鼠触液神经元的体外自我更新能力显著弱于乳鼠。

Orexin A对麻醉大鼠前额叶皮层神经元单位放电的影响及其机制研究

目的研究orexinA对麻醉大鼠前额叶皮层神经元自发放电的影响,并初步探讨其作用机制。方法用玻璃微电极记录大鼠前额叶皮层神经元的单位放电,分别观察侧脑室给予orexinA、组胺H1受体拮抗剂pyrilamine、以及pyrilamine+orexinA后放电活动的变化。结果侧脑室给orexinA溶液可明显增加前额叶皮层神经元的自发放电频率;而给pyrilamine对前额叶皮层神经元自发放电频率无显著影响;给予pyrilamine预处理后,orexinA未能引起前额叶皮层神经元放电频率发生改变。结论OrexinA对麻醉大鼠前额叶皮层神经元放电活动有明显的兴奋性,这一作用可能与活跃的组胺能系统有关。

睡眠剥夺通过影响大鼠下丘脑组蛋白乙酰化调控神经元Orexin A的表达

目的:探讨睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)对大鼠下丘脑组蛋白乙酰化水平的影响,并观察乙酰化修饰是否影响神经元下丘脑促觉醒肽Orexin A的表达。方法:成年雄性大鼠24只,采用改良多平台睡眠剥夺法建立大鼠SD模型,随机分为对照组(n=6)和SD组(n=18);Western Blot法检测大鼠下丘脑组蛋白乙酰化水平的变化;免疫荧光法观察下丘脑Orexin A神经元。结果:与对照组相比,SD后1 d,3 d及6 d,下丘脑组蛋白H3亚基9位赖氨酸(H3K9)、H3K14位点的乙酰化水平明显下降(P<0.05),但三个时间点之间无显著差异(P>0.05)。SD后3 d,下丘脑的Orexin A+神经元数目和对照组相比明显减少(P<0.05),而给予组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA(25 mg/kg,i.p.)可部分恢复SD减少的Orexin A^+神经元数(P<0.05)。结论:睡眠剥夺可能通过影响大鼠下丘脑组蛋白的乙酰化修饰水平减少神经元Orexin A的表达。

不同时长REM期睡眠剥夺及莫达非尼干预后大鼠下丘脑Orexin A神经元的表达

目的:探讨不同程度快动眼睡眠(REM)期睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)及莫达非尼干预后大鼠下丘脑Orexin A神经元的表达。方法:将成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为和SD组和对照组,SD组又分为用药组(drug group,DG)和非用药组(non-drug group,NDG),每组分SD12,24,48,72,96h共5个小组;对照组(cage control,CC)1个小组,正常饲养于笼中。每小组3只大鼠。采用小平台水环境法建立大鼠REM期SD模型。免疫组化方法观察大鼠下丘脑Orexin A阳性神经元的数量。结果:Orexin A阳性表达在SD12,24h时长的DG组与NDG组表达较CC组均有增加(P<0.05)而二者之间差别不明显(P>0.05);在SD48,72,96h时长的NDG组的表达较CC组下降(P<0.05),而DG组和CC组间无显著差异(P>0.05)且明显高于NDG组表达(P<0.05)。结论:推测莫达非尼可能是通过活化下丘脑促觉醒肽Orexin A的分泌和表达实现促觉醒作用。

兔脑内Orexin B免疫阳性神经元的分布定位

采用免疫组织化学方法研究了10只青紫蓝兔脑内Orexin B免疫阳性神经元的分布定位。结果显示,Orexin B免疫阳性神经元分布于下丘脑的室旁核、背内侧核、穹隆周核、外侧区和后区以及底丘脑的未定带。以下丘脑背内侧核、穹隆周核和外侧区的阳性神经元数量较多,下丘脑室旁核、后区和未定带较少。表明了兔脑内Orexin B免疫阳性神经元的分布与Orexin A免疫阳性神经元的分布存在一些差异,提示两种Orexin的产生部位和生理功能可能也存在差异。

大鼠下丘脑室旁核与orexin神经元的纤维联系及其在癫痫中的活性研究

目的:观察大鼠下丘脑室旁核(PVN)神经元和下丘脑orexin神经元在癫痫发作后的活性变化,以及相互之间的纤维联系。方法:制作匹罗卡品癫痫大鼠模型,免疫组织化学方法检测PVN内神经元和orexin神经元表达c-Fos情况;BDA顺行神经示踪实验观察PVN内神经元的纤维向orexin神经元分布区域的投射情况;CTb逆行神经示踪实验观察orexin神经元向PVN的投射情况。结果:PVN内神经元和orexin神经元在癫痫大鼠中的活性明显提高;PVN神经元向orexin集中分布的区域有大量的神经纤维投射;orexin神经元也可以投射到PVN。结论:PVN神经元和orexin神经元参与癫痫发作,PVN与orexin神经元之间存在相互神经纤维联系,可能在癫痫发作及伴发功能性障碍中发挥着重要的作用。

大鼠中脑导水管周围灰质向下丘脑orexin神经元的纤维投射

目的:明确中脑导水管周围灰质(PAG)神经元调节下丘脑orexin神经元的解剖学基础。方法:首先采用逆行示踪技术,将霍乱毒素B亚单位(CTb)作为逆行示踪剂注射到下丘脑orexin神经元胞体分布的区域,免疫组织化学方法染色观察PAG内CTb逆行标记细胞的分布特点;接着采用顺行示踪技术和免疫组化相结合的方法,将生物素化葡聚糖胺(BDA)作为顺行示踪剂注射到PAG,观察下丘脑内BDA标记的神经纤维与orexin神经元的重叠分布特点;最后运用免疫电镜技术观察BDA标记轴突终末与orexin神经元之间的突触联系。结果:CTb注射到单侧下丘脑orexin神经元区域后,在PAG观察到大量CTb标记神经元,注射点同侧标记细胞数明显占优,其中PAG外侧区(lPAG)和腹外侧区(vlPAG)可见大量CTb逆标神经元,背外侧区(dlPAG)和背内侧区(dm PAG)可见少量标记神经元;注射点对侧lPAG及vlPAG区域也观察到少量CTb标记神经元。BDA注射到单侧lPAG后,下丘脑内双侧均可观察到BDA标记的神经纤维,但注射点同侧标记神经纤维数量明显占优。BDA标记纤维与orexin神经元胞体在穹窿背侧接近不定带(ZI)的区域(本文中将此区域称作"穹窿上区")形成显著的重叠分布。透射电镜下观察到BDA标记的轴突终末与orexin神经元之间形成突触联系,且多为非对称性类型。结论:lPAG投射到下丘脑的神经纤维在穹窿上区与orexin神经元形成优势重叠分布、并与orexin神经元的胞体或树突形成以非对称性为主的突触联系,提示orexin神经元可能在lPAG的直接支配下发挥其调节觉醒状态、摄食行为等功能。

β淀粉样蛋白对缺氧缺血性脑损伤新生鼠神经元凋亡影响的实验研究

目的:通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,以β淀粉样蛋白(Aβ)为切入点,研究其在模型的表达以及与神经元凋亡的关系,探讨Aβ在新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型中对神经元的作用及机制。方法:建立10日龄新生大鼠缺血性脑损伤模型,模型后2、4、8、24 h心脏灌注,分别检测脑组织中Aβ、脑内淀粉样前体蛋白(APP)、β-分泌酶(BACE1)、Caspase-3、Cleaved caspase-3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的蛋白表达,BACE1的mRNA表达。使用BACE1抑制剂干预,实验分为三组,缺氧缺血组、抑制剂组和溶剂组,抑制剂组在缺氧缺血后即给予BACE1抑制剂AZD3293处理24 h后再次检测以上指标。结果:APP、Aβ的蛋白表达、BACE1的蛋白表达和mRNA水平在建模后呈时间依赖的上升,24 h达到高峰。同时,促凋亡蛋白Cleaved caspase-3在建模后也呈时间依赖的上升,24 h达到高峰。而在缺氧缺血2 h后,凋亡抑制蛋白Bcl-2的蛋白水平显著升高(P<0.05)。之后逐渐降低,24 h最低。当使用BACE1抑制剂后,Aβ及BACE1在脑组织中的表达显著下降(均P<0.05),而BACE1mRNA的表达没有变化(P>0.05)。同时促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达明显下降(P<0.05),同时,Bcl-2蛋白的表达也显著升高(P<0.05)。结论:在新生鼠HIBD时Aβ产生增多,应用BACE1抑制剂可降低Aβ的表达,增加Bcl-2的表达,减轻神经元凋亡。

养阴宁神方对去势小鼠海马神经元突触的可塑性调节

目的观察养阴宁神方对雌性小鼠去势后认知功能的影响。方法将60只C57BL/6J雌性小鼠随机分为假手术组,模型组,雌激素组,低、中、高剂量组,每组10只。假手术组仅切开皮肤和腹膜,不摘除小鼠的卵巢;其余各组均进行双侧卵巢切除术。假手术组、模型组均给予等容量的生理盐水(0.1 mL/10 g),雌激素[雌二醇(estradiol,E2),0.09 mg/kg]组及低剂量组(9.459 g/kg)、中剂量组(18.459 g/kg)、高剂量组(36.99 g/kg)灌胃药液,均灌胃3周。记录小鼠术后伤口愈合时间,去势前、去势1周、去势4周进行水迷宫潜伏实验和穿梭实验测试小鼠的学习记忆功能。采用ELISA法测定血清E2含量;HE染色观察小鼠海马神经元的形态;尼氏染色观察海马神经尼氏染色阳性细胞的数量;共聚焦显微镜下观察小鼠海马神经元细胞超微结构情况。结果与假手术组相比,模型组伤口愈合时间延长(P<0.05);与模型组、雌激素组及低、高剂量组比较,中剂量组伤口愈合时间缩短(P<0.05)。去势1周,与假手术组比较,模型组、雌激素组及低、中、高剂量组逃避潜伏期延长、穿梭次数减少(P<0.05)。去势4周,与假手术组比较,模型组逃避潜伏期延长、穿梭次数减少(P<0.05);与模型组相比,雌激素组及低、中、高剂量组逃避潜伏期缩短、穿梭次数增加(P<0.05)。去势4周,与假手术组比较,模型组E2浓度明显降低(P<0.01);与模型组比较,雌激素组及低、中、高剂量组E2浓度明显增高(P<0.01)。尼氏染色显示,与假手术组比较,模型组尼氏阳性细胞数减少(P<0.01);与模型组比较,雌激素组及低、中、高剂量组尼氏阳性细胞数增加(P<0.01)。HE染色显示,假手术组,雌激素组,低、中、高剂量组锥体神经元增多,且突起明显;模型组锥体神经元较少、颗粒细胞较多。共聚焦显微镜下见,假手术组,雌激素组,低、中、高剂量组海马神经元囊泡和突触粗面内质网结构增多;模型组海马神经元囊泡和突触减少。结论养阴宁神方可能通过提高血浆E2水平、改善海马神经元突触形态和功能可塑性、增加去势小鼠的认知功能,从而发挥脑保护作用。

不同饥饿刺激对下丘脑穹隆周区orexin-A神经元的影响

目的:通过观察下丘脑穹窿周区orexin-A神经元对不同刺激方式的反应特性探索能够激活该系统的高效而适宜的方法。方法:采用禁食、腹腔注射胰岛素和2-DG三种饥饿刺激方式,利用免疫组织化学染色及ELISA检测相结合的方法对大鼠穹隆周区orexin-A神经元的Fos的表达,脑脊液中orexin-A的浓度进行了对比分析。27只SD大鼠随机分为六组,分别进行禁食2 d,腹腔注射胰岛素或生理盐水存活5 h,腹腔注射2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)或生理盐水存活2 h和正常对照处理,动物的饮水量保持正常。结果:三种饥饿刺激引发的Fos表达比较类似,主要集中于下丘脑背内侧核,下丘脑外侧区和下丘脑后区,2-DG组的Fos表达最为浓密。三种刺激对orexin-A神经元的数量无明显影响,但orexin-A/Fos双标细胞数占所有orexin-A阳性细胞数的比例以2-DG组最高,为26%;禁食2 d组次之为21%;胰岛素组最低为14%。禁食组和2-DG组的双标细胞率与胰岛素组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果显示禁食组脑脊液中orexin-A的含量显著高于对照组23%,而其它两组与对照组相比没有差别。结论:本研究提示orexin-A的功能状态与刺激方式密切相关:急性刺激如2-DG注射适于研究神经元的激活状态,而慢性刺激如禁食适于研究激活后导致的orexin-A表达变化。