orexin-B细胞及其神经纤维在癫痫模型大鼠癫痫发作不同时间点的变化及其意义

目的:观察癫痫模型大鼠orexin-B细胞及其神经纤维在致痫后不同时间点的变化,阐明其在癫痫发作中的作用。方法:用海人酸(KA)腹腔注射诱发大鼠癫痫发作,并分别于癫痫终止后8 h、1 d、3 d、7 d和慢性复发时间点采用免疫组化方法检测orexin-B免疫反应阳性细胞数及其神经纤维的变化。结果:orexin-B免疫阳性细胞主要分布在大鼠下丘脑和穹窿周围核,但是在海马有可疑的阳性,而其免疫阳性神经纤维分布广泛;orexin-B免疫阳性细脃数呈现为先稍微减少后恢复、之后减少再恢复的趋势;7 d组细胞数减少,与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05),而其免疫反应神经纤维平均光密度值呈现出与其细胞数相反的变化。结论:orexin-B细胞数及其神经纤维在大鼠癫痫发生过程中有变化,其可能参与了癫痫的神经元放电和传播的调节,增加其浓度有助于对癫痫的控制。

Orexin-B对大鼠丘脑底核神经元自发放电及运动行为影响

目的探讨orexin-B对正常大鼠丘脑底核神经元自发放电及运动行为的影响。方法应用在体电生理细胞外记录的方法观察orexin-B对大鼠丘脑底核神经元自发放电频率的影响,并采用提升躯体摇摆实验(EBST)观察丘脑底核微量注射orexin-B后大鼠运动行为随时间变化。结果大鼠丘脑底核微压力注射orexin-B,神经元放电频率平均升高(96.85±17.42)%(t=10.242,P<0.01),与生理盐水对照组的细胞反应百分数比较差异有极显著性(Z=-4.157,P<0.01)。EBST结果显示,单侧丘脑底核微量注射orexin-B引起大鼠向对侧摇摆,两组在观察的30、45s向对侧偏转的频率比较,差异有显著性(F=80.35,t=13.42、21.54,P<0.01)。结论 Orexin-B可提高正常大鼠丘脑底核神经元兴奋性,提示orexin-B可能通过基底神经节间接通路参与大鼠运动行为调控。

脑室内注射orexin-A和orexin-B对下丘脑组胺释放的影响

目的观察脑室内微注射orexin-A和orexin-B对下丘脑组胺释放的影响,为orexins促麻醉觉醒的机制提供新的解释。方法成年雄性SD大鼠随机分为三组:生理盐水组、orexin-A组和orexin-B组。在立体定位仪下将微透析管置入下丘脑结节乳头体核区。实验分为两部分:先收集脑室内分别注射orexin-A、orexin-B 1nmol和5nmol后1、2h和3h的微透析液(n=5),采用高效液相色谱法(HPLC)检测微透析液中组胺含量的时程变化。1周后,各组大鼠分别注入不同剂量的orexin-A和orexin-B(10、15nmol和20nmol,n=5),收集微注射后1h的透析液,检测组胺释放的剂量效应。在立体定位仪下结节乳头体核置入微注射管,1周后给予1.4%异氟醚(1 MAC)麻醉30min,各组大鼠分别微注射生理盐水、orexin-A和orexin-B 0.3μl(n=6),记录翻正反射恢复时间。结果与生理盐水组比较,脑室内微注射orexin-A 1nmol 2h后下丘脑组胺含量明显增加,但同样剂量的orexin-B无明显作用,注射orexin-A和orexin-B 5nmol后2、3h组胺含量均明显增加(P<0.01)。脑室内微注射10nmol、15nmol和20nmol的orexin-A和orexin-B后1h组胺含量明显高于生理盐水,且20nmol含量最高(P<0.05)。结节乳头体核微注射orexin-A后翻正反射恢复时间明显短于生理盐水(P<0.01),微注射orexin-B后无明显作用。结论脑室内微注射orexin-A和orexin-B均可促进下丘脑组胺递质的释放,但orexin-A的作用更强。结节乳头体核微注射orexin-A促进异氟醚麻醉的觉醒。

丘脑底核orexin-B对正常小鼠运动行为调控及机制

目的探究丘脑底核orexin-B对正常小鼠运动行为的调控及神经元自发放电的影响。方法分别采用爬杆实验、旷场实验和在体细胞外电生理记录等方法,观察丘脑底核微量注射orexin-B对小鼠运动的调控以及神经元自发放电的影响。结果双侧丘脑底核注射orexin-B可以明显延长正常小鼠爬杆转头时间(t=2.40,P<0.05)和爬杆时间(t=4.59,P<0.01)。旷场实验结果显示,双侧丘脑底核注射orexin-B显著减少小鼠运动总距离(t=3.14,P<0.01)。在正常小鼠丘脑底核记录到11个神经元,微压力注射orexin-B使其中7个神经元的放电频率显著升高(t=4.96,P<0.01),放电频率平均升高(216.90±118.40)%,与生理盐水对照组比较差异有显著性(Z=-2.72,P<0.01)。结论 Orexin-B能增加丘脑底核神经元自发放电,抑制正常小鼠的运动行为,可能通过丘脑底核参与基底神经节间接通路的调控运动。

兔脑内Orexin B免疫阳性神经元的分布定位

采用免疫组织化学方法研究了10只青紫蓝兔脑内Orexin B免疫阳性神经元的分布定位。结果显示,Orexin B免疫阳性神经元分布于下丘脑的室旁核、背内侧核、穹隆周核、外侧区和后区以及底丘脑的未定带。以下丘脑背内侧核、穹隆周核和外侧区的阳性神经元数量较多,下丘脑室旁核、后区和未定带较少。表明了兔脑内Orexin B免疫阳性神经元的分布与Orexin A免疫阳性神经元的分布存在一些差异,提示两种Orexin的产生部位和生理功能可能也存在差异。

兔中枢神经内Orexin B免疫阳性神经纤维的分布

采用免疫组织化学方法研究了青紫蓝兔中枢神经系统(CNS)内orexin B免疫阳性纤维的分布。结果显示,orexin B免疫阳性神经纤维广泛分布于CNS内,在端脑分布于大脑皮质、隔核和杏仁核;在间脑分布于丘脑、下丘脑、上丘脑和垂体,主要分布于丘脑中线核和下丘脑;在中脑分布于中脑中央灰质、前丘、后丘、脚间核和中缝核;在脑桥分布于蓝斑、被盖背侧核和中缝核;在延髓分布于最后区、孤束核和迷走神经背侧运动核;在小脑和脊髓也有分布。兔CNS内orexin B免疫阳性纤维的分布与orexin A的基本相似,本试验结果为理解orexin B在兔体内的作用部位提供了形态学资料。

Orexin B在猪下丘脑-垂体-性腺轴的分布及对生殖调节的体外研究

本试验采用免疫组化和放射免疫测定的方法对Orexin B在1月龄健康苏钟猪和和性成熟青年母猪下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴的分布定位及其在HPG轴各级水平的直接分子生物学作用进行了研究。结果显示,Orexin B在下丘脑、垂体和性腺均有分布。在下丘脑的分布比较广泛,其中以穹隆周区、外侧区、背内侧核和后区的Orexin B免疫阳性神经元分布最为密集,而下丘脑前区、视前区和视交叉上核的Orexin B免疫阳性神经元分布较少。在垂体Orexin B主要分布在腺垂体的远侧部和中间部的内分泌细胞内。在性腺器官,Orexin B主要分布在初级卵泡、次级卵泡的颗粒细胞以及卵母细胞的细胞质和睾丸、附睾间质细胞内;用不同剂量的Orexin B处理体外培养的下丘脑脑片、腺垂体细胞和卵巢颗粒细胞,其中1000nmol·L-1剂量组Orexin B能极显著的刺激GnRH的释放(P<0.01),100和1000nmol·L-1剂量组能显著(P<0.05)刺激LH和E2的释放。结果表明Orexin B在HPG轴各级水平直接参与猪生殖活动的调节。

半滑舌鳎食欲素B的体外重组制备与生物活性分析

为了认识食欲素(orexin)编码的多肽orexin B对半滑舌鳎摄食的调控作用及机制,利用原核表达载体p ET-32a成功构建了重组半滑舌鳎orexin B/pET-32a质粒,转化至大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸分子标签的orexin B重组蛋白。重组蛋白大小为21.14 ku,在温度37°C条件下以1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h的orexin B重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的43.5%,并主要分泌于上清液中。Western blotting免疫印迹表明,获得的orexin B重组蛋白可被6×His抗体特异性识别。Ni^(2+)-NTA亲和层析柱纯化可获得高纯度的半滑舌鳎orexin B重组蛋白。离体孵育实验表明,orexin B重组蛋白能促进下丘脑神经肽Y(NPY肽)的分泌和NPY,orexin mRNA的表达,表明获得的重组蛋白在激素和基因水平上调控下丘脑摄食相关神经肽的表达,具有明显的生物活性。研究结果可为半滑舌鳎orexin B蛋白的批量制备及高效促食生物制剂的研制提供技术支撑。

食欲素B及其受体在胃癌患者血清和组织中的表达及意义

目的研究胃癌患者血清中食欲素B(Orexin B)的水平及其受体在胃癌组织中的表达,进一步分析Orexin B在胃癌发生、发展过程中的作用。方法用ELISA法检测胃癌患者血清和同期健康体检者血清中的Orexin B的含量;免疫组织化学法检测胃癌组织和正常胃黏膜组织中食欲素1型受体(OX1R)和2型受体(OX2R)的分布情况。结果胃癌患者血清中Orexin B水平低于健康体检者(P<0.05);OX1R在胃癌组织中的阳性表达率和阳性染色分值均较对照组高(P<0.05);与正常组织相比,胃癌组织中OX2R的阳性染色率和染色分值与正常胃黏膜组织差异无统计学意义(P>0.05)。胃癌组织中OX1R的阳性染色分值高于OX2R的表达(P<0.05)。结论胃癌患者血清中Drexin B呈低水平状态,但是其受体呈现不同程度的表达状态。

Orexin B在猪中枢神经系统的分布定位

本试验采用免疫组织化学方法对10头苏钟猪中枢神经系统Orexin B的分布定位进行了研究。结果表明,Orexin B免疫阳性神经元和纤维在猪下丘脑、脑干和脊髓均有分布。在下丘脑,阳性神经元和纤维分布于视前区、视交叉上核、室旁核、室周核、背内侧核、穹隆周核、乳头体核、外侧区和后区,其中以穹隆周区、背内侧核、未定带和下丘脑后区分布较密集,以视前区、视交叉上核、下丘脑外侧区和乳头体核分布较稀少。在脑干,阳性神经元分布于蓝斑、前庭神经核、下橄榄核、孤束核和疑核。在脊髓,阳性神经元较少,主要分布于颈部脊髓背角第Ⅳ层。此外,在斜角带、隔区、终纹床核等部位观察到密集的阳性纤维分布。本试验为进一步研究Orexin B的生理功能奠定了基础。

调控采食量的神经肽--Orexin的研究进展

Orexin是1998年发现的一种肽类物质,其神经元主要分布在下丘脑。自orexin被发现的几年来,许多研究者对其进行了大量的研究。本文对orexin的结构、分布定位、生理功能做了相关综述,为orexin的应用研究做理论铺垫。

食欲素-B抑制大鼠脑缺血再灌注损伤

目的研究食欲素-B(orexin-B,OXB)对大鼠脑缺血再灌注的神经保护作用及其分子机制。方法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO),将大鼠随机分为:假手术组(control)、缺血再灌注组(I/R)、缺血再灌注+PBS组(I/R+PBS)和缺血再灌注+orexin-B组(I/R+OXB);通过神经功能评分确定模型是否成功;TTC染色法测定大鼠脑梗死体积;Western blot检测海马区食欲素受体2(OX2R)、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达;跳台实验检测大鼠学习与记忆。结果 I/R组海马中OX2R及p-AKT蛋白表达较对照组减少(P<0.05),p-GSK-3β蛋白表达增加(P<0.05),而I/R+OXB组上述变化明显减轻(P<0.05);I/R+OXB组脑梗死体积明显减少,I/R组潜伏期时间减少,错误次数增多(P<0.05),而I/R+OXB组上述变化显著减小(P<0.05)。结论食欲素-B抑制脑缺血再灌注损伤,可能与增强p-AKT活性、抑制p-GSK-3β活性有关。

食欲素B增强外膝体纤维投射至视皮层第6b层锥体细胞的突触传递

[目的]探究食欲素B(Orexin B)调控外膝体(LGN)纤维投射至视皮层(visual cortex,VC)第6层b亚层(L6b)中的食欲素B敏感神经元(Orexin敏感神经元)的突触传递作用.[方法]选用P25~P30的C57小鼠,脑立体定位注射CTB555或者ChR2-EGFP,分别标记VC中L6b反馈投射到LGN的神经细胞和源自LGN前馈投射至L6b的神经纤维.膜片钳的方法记录CTB555标记的L6b中的神经细胞的突触后电流(EPSC),电刺激皮层白质或蓝光刺激ChR2-EGFP(Channelrhodopsin 2-Enhanced Green Fluorescent Protein)标记的LGN投射到VC的神经纤维.[结果]从L6b反馈投射至LGN的神经细胞中,92.5%为锥体神经元,且这些锥体神经细胞中有63.3%的细胞对Orexin B受体激动剂敏感.电刺激或光刺激LGN前馈投射至L6b的神经纤维,Orexin B增强L6b中Orexin敏感细胞的突触后NMDAR电流[电刺激:(125.1±3.7)%,光刺激:(123.8±3.8)%,在OX2R阻断剂的存在下,Orexin B对突触后电流振幅的效应消失,具有明显统计学意义,P<0.05],因此,OrexinB增强LGN——Orexin敏感神经细胞之间的突触传递.[结论]Orexin B增强外膝体(LGN)纤维投射至视皮层L6b中的锥体细胞之间的突触传递.

食欲素B增强视皮层第2/3层传入到第6b层锥体神经细胞的突触传递

【目的】研究小鼠视皮层第6b层中对食欲素(Orexin B)敏感的神经元的细胞类型以及食欲素调控其敏感神经元中来自第2/3层传入的突触传递和机制。【方法】用生物细胞素(biocytin)标记小鼠视皮层第6b层中被Orexin B受体激动剂直接兴奋的神经细胞,双光子显微镜下观察这些神经元的细胞形态;外膝体注射逆行标记荧光染料(CTB555)标记小鼠视皮层第6b层中反馈投射到外膝体的神经元,电刺激视皮层第2/3层传递到第6b中由CTB555标记的、反馈投射到外膝体的神经元的传入神经通路,并记录兴奋性突触后电流(EPSC)。【结果】在视皮层第6b层中58.1%的锥体细胞和52.9%的多极细胞是Orexin B敏感的神经元;Orexin B能增强第6b层中经CTB555标记的、反馈投射到外膝体的神经元中来自第2/3层的传入纤维的突触传递。这种增强作用可分别被Orexin B2型受体阻断剂[Ctr:(119.33±2.51)%,n=15 cells,7 mice;TCS OX229:(103.17±2.75)%,n=30 cells,10 mice;P<0.001]、磷脂酶C抑制剂[Ctr:(125.51±1.4)%,n=11 cells,5 mice;U173332:(103.89±1.04)%,n=10 cells,5 mice;P<0.001]、细胞内Ca2+螯合剂[Ctr:(125.54±1.53)%,n=11 cells,5 mice;BAPTA:(102.86±1.7)%,n=9 cells,4 mice;P<0.001]和mGluR5受体拮抗剂所阻断[Ctr:(126.14±3.87)%,12 cells,5 mice;MPEP:(106.32±2.65)%,n=12 cells,6 mice;P<0.001]。【结论】小鼠视觉皮层第6b层中,大部分锥体神经元和多极神经元是Orexin B敏感的神经元,第6b层中反馈投射到外膝体的神经元细胞膜上的食欲素受体被激活后可以通过激活细胞内磷脂酶C的活性而增强来自第2/3层的传入的突触传递。

加味半夏秫米汤对失眠模型大鼠下丘脑食欲素及其受体的调控作用

【目的】观察加味半夏秫米汤对对氯苯丙氨酸(PCPA)诱导的失眠模型大鼠的治疗作用及机制。【方法】将48只雄性SD大鼠随机分成6组,即正常组,模型组,中药低、中、高剂量组和地西泮组,每组8只。造模前连续7 d,中药低、中、高剂量组大鼠分别给予加味半夏秫米汤进行预防性治疗。除正常组外,其余各组大鼠均构建PCPA诱导失眠模型。第1天造模后,各组继续对应给药,连续7 d。监测体质量,进行旷场试验行为学检测,采用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清中食欲素A(OXA)和食欲素B(OXB)含量,免疫组织化学法检测下丘脑食欲素受体1(OX1R)的表达,苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠下丘脑的病理变化。【结果】(1)造模前各组大鼠体质量增长趋势平稳,组间无明显差异;造模后除正常组外,其余各组大鼠体质量增长速度减缓甚至下降;给予加味半夏秫米汤14 d后,与模型组比较,中药中剂量组大鼠体质量上升显著(P<0.01)。(2)与正常组比较,模型组大鼠在旷场中活动总距离、中央区域的活动距离及进入中央区域的次数增加(P<0.01),血清OXA和OXB含量显著升高(P<0.01),下丘脑OX1R的表达显著升高(P<0.01),HE染色显示下丘脑胶质细胞轻度增生;与模型组比较,中药中剂量组和地西泮组大鼠在旷场中活动总距离、中央区域的活动距离及进入中央区域的次数减少(P<0.01),血清OXA和OXB含量显著降低(P<0.01),下丘脑OX1R的表达显著降低(P<0.01),HE染色显示大量神经元周围间隙增大,局部胶质细胞轻度增生。【结论】加味半夏秫米汤可通过下调血清中OXA和OXB的含量及下丘脑中OX1R的表达来改善大鼠失眠,减轻大鼠焦虑状态。

Orexin-A介导histamine能神经系统促进氯胺酮麻醉觉醒

目的:探索氯胺酮麻醉下,Orexin神经信号是否激活结节乳头体核(Tuberomammillary Nucleus,TMN)促进大鼠氯胺酮麻醉觉醒。方法:成年雄性SD大鼠(体重230-280 g),在10%水合氯醛麻醉下(1 ml/kg,i.p.)进行以下实验:1TMN核团埋置微注射外套管,回笼单独饲养7天后,大鼠随机分为三组,分别为对照组(NS)、orexin-A组与orexin-B组。TMN核团分别双侧微注射NS(0.3μL)、orexin-A(100 pmol/0.3μL)及orexin-B(100 pmol/0.3μL)观察氯胺酮麻醉下(100 mg/kg,腹腔注射)大鼠诱导时间与觉醒时间;2上述实验7天后,大鼠随机分为三组,分别为溶剂DMSO组、SB334867组与TCS-OX2-29组,TMN核团分别双侧微注射DMSO(0.3μL)、orexin 1型受体(the orexin type 1 receptor,OX1R)的拮抗剂SB334867(20μg/0.3μL)和orexin 2型受体(the orexin type 2 receptor,OX2R)的拮抗剂TCS-OX2-29(20μg/0.3μL)观察氯胺酮麻醉下大鼠诱导时间与觉醒时间。结果:1各组大鼠的诱导时间无统计学差异。2在TMN核团微注射orexin-A与对照组相比明显缩短了大鼠的觉醒时间(43.17±6.31 min vs51.17±4.45 min,P<0.05),而微注射orexin-B与对照组相比并没有明显影响大鼠的觉醒时间(50.33±3.50 min vs 51.17±4.45min,P>0.05)。3TMN核团微注射OX1R拮抗剂SB334867较溶剂DMSO组延长了麻醉觉醒时间(60.83±8.84 min vs 49.00±5.73 min,P<0.05),OX2R拮抗剂TCS-OX2-29与溶剂DMSO组相比并没有明显影响大鼠的觉醒时间(50.83±4.79 min vs 49.00±5.73 min,P>0.05)。结论:本研究实验证据证实在氯胺酮麻醉下,orexin神经信号可能通过激活TMN区组胺能神经系统促进麻醉向觉醒的转换。