地衣芽孢杆菌YP1A耐有机溶剂蛋白酶基因的克隆与功能表达

根据B.licheniformisYP1A来源的碱性蛋白酶具有的高强度耐有机溶剂性能及相关数据库分析,采用PCR克隆B.licheniformisYP1A耐有机溶剂碱性蛋白酶基因,序列分析显示该基因(1 264 bp)包含启动子与编码380个氨基酸的开放阅读框(ORF),ORF包括信号肽、前肽及编码254个氨基酸的成熟肽序列。相关基因分析表明,YP1A耐有机溶剂碱性蛋白酶基因与地衣芽孢杆菌ATCC14580的碱性蛋白酶基因仅有6个氨基酸残基差异。构建2种含YP1A碱性蛋白酶CDS的组成型穿梭表达载体pHY/aprYP与pHY/aprP43,前者采用YP1A蛋白酶自带的启动子,后者则采用来自于质粒pP43NMK的P43强启动子。利用这2种表达载体在枯草芽孢杆菌WB800中成功进行蛋白酶的功能表达,其中P43强启动子的表达能力明显优于碱性蛋白酶自带的启动子,表达的蛋白酶比酶活为395 U/mL。重组菌表达的碱性蛋白酶在体积分数50%的亲水及疏水有机溶剂中表现出了很好的耐受性,验证了克隆基因为地衣芽孢杆菌YP1A的高强度耐有机溶剂碱性蛋白酶基因。

高强度耐有机溶剂蛋白酶的纯化及性质

分离纯化了自行筛选的耐有机溶剂的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YP1所产的溶剂稳定性蛋白酶.发酵液经硫酸铵沉淀、疏水层析及强阳离子交换层析纯化,得到电泳纯的蛋白酶;分子量约为28kDa,纯化蛋白酶的比酶活达到1.18×105U/mg,纯化倍数为37.2,酶活回收率为20.8%.纯化的YP1蛋白酶对50%(φ)的多种亲水或疏水有机溶剂具有很高的耐受性,其中50%(φ)的DMF和DMSO能显著促进YP1蛋白酶活力.YP1蛋白酶为Zn2+蛋白酶,最适反应温度为55℃,最适反应pH为10.0,pH8.0～13.0范围内具有高活力.以酪蛋白为底物,YP1蛋白酶的米氏常数Km为0.048g/L.

烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌YP1产胞外蛋白酶的影响

考察了添加5%(V/V)浓度的正庚烷、正辛烷、正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)YP1的生长及产胞外蛋白酶的影响。结果表明5%(V/V)浓度的各种烷烃溶剂对YP1蛋白酶的稳定性及菌体生物量均无显著影响,正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶剂显著抑制YP1产蛋白酶,而十二烷、十四烷、十六烷能提高YP1产蛋白酶1倍以上。发酵液中十四烷的浓度(1%-8%,V/V)与蛋白酶的活力呈正相关性,添加十四烷后发酵过程中蛋白酶活力的显著增加出现在菌体生长的对数后期。培养过程中添加十四烷能导致YP1菌体形态显著变小。首次报道了烷烃溶剂对极端微生物产蛋白酶的影响。

耐有机溶剂蛋白酶产生菌Bacillus cereus WQ9-2发酵条件及酶学性质

以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus WQ9-2为产耐有机溶剂蛋白酶的出发菌株,对其产酶条件进行优化并初步研究了其酶学性质。在单因素实验基础上,通过中心复合实验确定了产酶的最佳发酵条件为酵母粉8 g/L,葡萄糖17 g/L,KH2PO40.5 g/L,无水MgSO40.3 g/L,CaCl20.5 g/L,NaCl 1.0 g/L;pH 7.5。实验中发现采用低温发酵能大大缩短菌体产酶周期;通过优化发酵时间由最初84 h缩短到48 h,最高比酶活为3 921 U/mL。金属离子螯合剂1,10-菲罗啉(1,10-phenanthroline)、乙二胺四乙酸(EDTA)对该酶有较强的抑制作用,表明该酶可能为金属蛋白酶;Ca2+对该酶的活力及热稳定性有显著提高作用。

耐有机溶剂蛋白酶产生菌MSP05的筛选、鉴定及酶学性质研究

目的:从燕尾港受污染海域筛选耐有机溶剂蛋白酶产生菌,确定该菌的分类地位,并对其所产溶剂稳定性蛋白酶的酶学性质进行研究。方法:通过在培养基中添加20%(V/V)甲苯作为筛选压力,筛选耐有机溶剂极端微生物,通过产蛋白酶筛选培养基筛选产蛋白酶的菌株,并利用摇瓶发酵进行复筛,最后对产酶菌株进行鉴定并对粗酶的性质进行测定。结果:筛选获得耐有机溶剂蛋白酶产生菌MSP05,结合16S rDNA序列分析、形态学观察和生理生化性质将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该酶的最适反应温度和pH分别为50℃和10.0,Cu^(2+)、Mn^(2+)对酶有激活作用,Mg^(2+)、Fe^(3+)和Ba^(2+)对酶具有抑制作用。在50%乙醇中,25℃、140 r/min振荡72 h后仍能保持50%以上酶活力。结论:分离获得耐有机溶剂蛋白酶产生菌解淀粉芽孢杆菌菌株MSP05,对有机溶剂具有较好的耐受性,具有潜在的工业应用价值。

Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质

将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph进行毕赤酵母密码子优化后,进行全基因合成,并构建了重组酵母菌P.pastoris X33-ppicZalphA-sph,对重组酶进行酶学性质研究。结果表明,重组酶的最适反应温度和最适反应pH为40℃和8.0,且其为20～30℃中保温10 h仍有80%以上的酶活力、在pH7.0～9.0条件下孵育24 h,仍能保持60%以上的酶活性。K^+、Sr^(2+)对酶活有明显激活作用,而Fe^(3+)、Ba^(2+)对酶活有明显抑制作用;重组蛋白酶SPH在极性常数为0.8～3.1的25%的正丁醇、环己烷、二甲苯中孵育6 d后,仍能保留50%以上的酶活性。本研究为B.phaericus 2297和B.phaericus DS11蛋白酶有机溶剂耐受性机制的研究奠定基础。

南极海洋产耐有机溶剂变性剂氧化剂蛋白酶链霉菌菌株XE-1的初步鉴定及酶学性质(英文)

【目的】从南极海泥土壤中分离得到一株高产蛋白酶的放线菌(XE-1),对所产蛋白酶进行纯化以得到具有特殊性质的酶产物。【方法】通过对XE-1的生理生化和16S rRNA基因序列分析,初步将其确定为灰红链霉菌的变种。利用乙醇沉淀、离子交换、凝胶等方法纯化后,利用冻干浓缩获得其胞外蛋白酶,用SDSPAGE测定分子量并进行性质表征。【结果】得到一种对高浓度的有机溶剂、变性剂、氧化剂耐受的,表观分子量为14kDa的碱性丝氨酸蛋白酶,进一步分析,其最适pH 8.2,温度为55℃,米氏常数Km和Vmax分别为1.9mg/mL和973 u/mL。此蛋白酶活性于25%的有机溶剂为50%-180%的初始活性;在不同浓度的氧化剂中为110%-140%的初始活性,在0.2 mol/L到4 mol/L的变性剂中表现为100%-150%的初始活性。【结论】从南极海洋链霉菌XE-1中分离得到一种耐有机溶剂、变性剂、氧化剂,大小约为14kDa碱性蛋白酶,其特殊的酶学性质可用于工业生产或药学等领域。