中国大陆两种东毕吸虫rDNA-LSU基因的序列分析

目的 测定程氏东毕吸虫、土耳其斯坦东毕吸虫结节变种rDNA LSU基因序列 ,并对照已发表的土耳其斯坦东毕吸虫同一基因序列 ,比较三者的差异 ,探讨东毕吸虫虫种分类问题。 方法 收集两虫种成虫 ,GNT K法抽提基因组DNA ,PCR扩增目的基因 ,并将其产物克隆入质粒再次扩增 ,提取质粒DNA ,以M 13(F/R)作为测序引物进行测序。从GenBank获得土耳其斯坦东毕吸虫rDNA LSU基因序列 ,用BioEdit软件将 3种血吸虫基因序列排序并比较分析。 结果 程氏东毕吸虫、土耳其斯坦东毕吸虫结节变种的LSU序列完全一致 ,与土耳其斯坦东毕吸虫rDNA LSU基因序列仅相差一个碱基 ,同源性高达 99.99%。 结论 γDNA LSU基因序列分析结果不支持程氏东毕吸虫为独立种 ,土耳其斯坦东毕吸虫结节变种可能是土耳其斯坦东毕吸虫的同种异名。

程氏东毕吸虫成虫体表扫描电镜观察

目的 描述程氏东毕吸虫体表扫描电镜 (SEM)显微结构。方法 成虫虫体采自自然感染的绵羊 ,经 2 5 %戊二醛固定、扫描前将虫体用 1%锇酸固定、经酒精梯度脱水、溅射喷涂金膜处理 ,最后以日立JSM - 80 0扫描电镜观察并摄片。结果 雄虫体表满布皮层皱褶及感觉球 ,雌虫前、中部体表较光滑 ,后部体表上有一定数量的棘和感觉球 ,但无带孔皮层增厚块。结论 SEM结果分析 :雄虫体表感觉球为程氏东毕吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫的共同体表特征 ,但感觉球数量及分布不尽相同 ,雌虫尾部也有棘和感觉球 ,但无带孔皮层增厚块 ,支持程氏东毕吸虫为一独立种。

4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1和nad1基因的序列分析

收集黑龙江省大庆地区牛源、绵羊源、绒山羊源和山羊源土耳其斯坦东毕吸虫，以SDS-蛋白酶K法抽提其基因组DNA，用特异性引物通过PCR扩增土耳其斯坦东毕吸虫成虫细胞色素C氧化酶亚基1基因（coxl）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1基因（nad1）并进行测序，应用Chromas和DNAStar软件分析扩增产物的变异情况。结果表明，大庆地区4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1基因均为1125bp，nad1基因均为518bp；且其线粒体基因存在差异，coxl的同源性为99．0％～99．7％，nad1的同源性为98．3％～99．4％。

绒山羊和绵羊源东毕吸虫ITS rDNA的PCR扩增及序列分析

目的扩增绒山羊和绵羊源东毕吸虫的ITS rDNA序列并进行分析比较。方法运用PCR方法,以保守引物BD1和BD2扩增从黑龙江绒山羊和绵羊体内分离的东毕吸虫(Orientobilharzia spp.)rDNA的内转录间隔区(ITS-1及ITS-2)。PCR产物经测序后进行序列分析。结果黑龙江绒山羊和绵羊东毕吸虫的ITS序列总长均为875bp,其中ITS-1序列长为384bp,5.8S序列长为159bp,ITS-2序列长为332bp。黑龙江绒山羊和绵羊东毕吸虫的ITS序列相似性为99.9%,只有一个碱基差异,存在于ITS-2序列中。结论本研究在国际上首次报道了绒山羊和绵羊东毕吸虫的ITS序列,证实绒山羊和绵羊源东毕吸虫代表同一个种。这些结果为东毕吸虫分子生物学的进一步研究奠定了基础,并为寄生虫分子系统学研究提供了新资料。

西藏尼木山羊自然感染东毕吸虫沉积虫卵分布与病理情况调查

【目的】研究西藏尼木县自然感染东毕吸虫山羊,虫卵在脏器中的分布与病理变化情况。【方法】解剖自然放牧的东毕吸虫阳性山羊,采集脏器(十二指肠、小肠上段、小肠中段、小肠下段、盲肠、结肠、直肠)显微镜下虫卵计数并观察病理变化。【结果】山羊自然感染东毕吸虫数量为1435±231.5,在脏器中,小肠中段的EPG最高,其次为盲肠和十二指肠,东毕吸虫虫卵在各脏器中的分布百分比是:十二指肠(3.50%)、小肠上段(12.57%)、小肠中段(56.41%)、小肠下段(0.52%)、盲肠(18.83%)、结肠(0.00%)、直肠(0.01%)、肝脏(8.16%)、脾脏(0.00%),小肠中段沉积的虫卵数与其他各组织相比差异极显著(P<0.01)。小肠部分沉积虫卵数(73.00%)明显高于大肠部分的虫卵沉积数(18.84%),差异极显著(P<0.01)。病理组织切片观察,发现小肠中段有大量虫卵肉芽结节,小肠粘膜发生炎症和轻度坏死。【结论】山羊感染东毕吸虫后不同的脏器沉积虫卵的密度和数量不同,虫卵计数与病理切片观察结果相关。

土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

将pGEM-TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白(TM)基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+),重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达出一37.5 ku的融合蛋白。该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测,出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明,纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别,这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。

牛羊源土耳其斯坦东毕吸虫ITS和28S rDNA-LSU序列分析

目的探讨牛羊源土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)核糖体内转录间隔区(ITS)和28S核糖体大亚基序列(rDNA-LSU)的差异。方法粪便检查、剖杀自然感染东毕吸虫的绒山羊、山羊、绵羊和黄牛,收集虫体,形态学鉴定为土耳其斯坦东毕吸虫。抽提成虫基因组DNA,扩增其ITS(包括ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2)和28S rDNA-LSU序列,测序并分析以上序列,以及28S rDNA-LSU序列RNA二级结构。结果牛、羊源土耳其斯坦东毕吸虫的ITS-1、5.8S rDNA、ITS-2和28S rDNA-LSU序列分别长384、159、331和1304bp。牛源和羊源的ITS-1和5.8S rDNA序列完全相同;黄牛源、绵羊源和绒山羊源的ITS-2序列完全相同,与山羊源存在1个碱基的差异;绵羊源和绒山羊源的28S rDNA-LSU序列完全相同,与牛源和山羊源分别有2个碱基的差异。绵羊源和绒山羊源的28S rDNA-LSU序列RNA二级结构相同,与山羊源存在微小差异,但牛源与羊源存在较大差异。结论不同终末宿主源土耳其斯坦东毕吸虫的核糖体序列存在不同程度的差异,羊源28S rDNA-LSU序列的RNA二级结构相同或相似,但与牛源存在较大差异。

东毕属三种吸虫分类地位的研究

东毕吸虫分类问题一直是大家比较关心的问题 ,本文根据课题研究情况并结合他人研究资料 ,对东毕吸虫属的三个种 ,即土耳其斯坦东毕吸虫、土耳其斯坦东毕吸虫结节变种和程氏东毕吸虫的光镜和电镜观察情况进行了比较和分析 ,并结合近期有关对虫体 DNA序列分析资料 。

土耳其斯坦东毕吸虫成虫cDNA文库的构建

按照SMARTcDNA文库构建试剂盒说明 ,以TRIZOL试剂提取的土耳其斯坦东毕吸虫成虫总RNA为模板 ,以含SfiⅠB酶切位点的oligo(dT)为引物反转录合成第一链cDNA ,利用含SfiⅠA酶切位点的SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA 5’端延伸出去的模板 ,采用LD -PCR技术以改良的oligo(dT)引物合成双链cDNA ,经蛋白酶K和SfiⅠ消化后 ,过CHROMASPIN - 4 0 0柱进行分级分离。双链cDNA与载体λTripEx2两臂连接 ,体外包装后构建成土耳其斯坦东毕吸虫成虫的cDNA噬菌体表达文库。经测定文库容量为 6 38× 10 6,文库扩增后的滴度为 3 4 8× 10 10 (Pfu/ml) ,PCR测定的重组率为 92 %。各项指标表明 ,我们成功的构建了高质量的cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆保护性抗原基因奠定了基础。

东毕血吸虫幼虫期在宿主体内发育的组织化学和扫描电镜观察

在内蒙古呼伦贝尔草原检获土耳其斯坦东毕吸虫幼虫期发育程度各不相同的阳性萝卜螺，通过组织学和组织化学方法对其幼虫期进行了观察． 参考周述龙（１９９１）对日本血吸虫尾蚴幼虫期进行的分期，把土耳其斯坦东毕吸虫的尾蚴发育过程也分为 ５ 期，尾蚴发育的胚细胞期、胚球期、尾蚴雏体期、尾蚴成熟前期和尾蚴成熟期． 子胞蚴育腔内胚细胞分裂，形成胚球，胚球中出现体细胞和胚细胞的分化，胚细胞结合疏松，胞浆中含酸性粘液和大量汞溴酚蓝反应阳性的碱性蛋白成分． 尾蚴成熟前后在三种腺体的呈色反应方面和日本血吸虫相似，其后钻腺腺体部分 Ｐ Ａ Ｓ反应呈阳性的含糖类物质在雏体期后期开始分泌，逐渐由腺管通向头器末端． 两种尾蚴在尾蚴的体实质部分，对 Ｐ Ａ Ｓ和汞溴酚蓝反应的呈色结果有着较大的差异． 另外，通过扫描电镜对土耳其斯坦东毕吸虫的尾蚴进行了比较观察，它们在头器的结构、体棘的形态以及感觉器的分布上存在着一定的差异．两种血吸虫的相似性表明在系统演化上有着密切的联系．

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种尾蚴皮层的超微结构观察

本文对土耳其斯坦东毕吸虫结节变种尾蚴皮层的超微结构进行了描述。尾蚴皮层从外向内由糖蛋白膜、外质膜、皮层基质、基质膜、基底膜组成。皮层基质为一较厚的致密层,无细胞界线及其它亚细胞结构,充满致密的细颗粒性物质。此层厚度变化较大,而致虫体表面凸凹不平。有两型致密体分布于皮层基质中。

内蒙古科尔沁草原绵羊不同虫龄土耳其斯坦东毕吸虫及虫卵孵化的实验观察

作者在内蒙科尔沁草原实验观察了绵羊体内62日龄及三年龄的土耳其斯坦东毕吸虫雌雄虫。三年龄虫体变小,大多数雄虫的睾丸内质呈不同程度空泡伏,部分雌虫的卵巢和卵黄腺萎缩或消失,体形变异。实验羊粪便的虫卵孵化率逐年下降,粪便散入水中后连续4—5天有毛蚴孵出,毛蚴数最多的是在次日上午,随后每天上午有一递减的小高峰,下午极少、夜间消失。

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种的染色体C带核型

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种的染色体C带核型表明:在雌性虫体,第1号染色体的短臂可见到一异染色质块。第2号性染色体的Z染色体不易出现C带,而W染色体从着丝点部位向长臂方向恒定的出现一大块异染色质。第3号、5号染色体不是恒定的出现C带。第4号染色体的端着丝粒非常明显。第6号、7号染色体在长臂末端分别可以见到一对异染色质块。在雄性.可清楚地见到2号性染色体为同形性染色体,两条同源染色体都没有异染色质出现。其它染色体的C带同雌性虫体。

基于线粒体nad4基因探讨土耳其斯坦东毕吸虫的系统发生位置

为探讨土耳其斯坦东毕吸虫在血吸虫中的系统发生位置,本研究设计一对特异性引物,通过PCR方法对土耳其斯坦东毕吸虫(绵羊源)线粒体烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ基因(nad4)进行扩增和测序分析,并与GenBank中相关血吸虫nad4基因进行比对。结果显示,本研究克隆的该吸虫线粒体nad4基因序列大小约为1030bp,与已发表的其它血吸虫线粒体nad4基因的同源性为51.6%～66.7%,其系统发生位置属于非洲血吸虫种群。

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种的染色体C带核型

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种的染色体C带核型表明;在雌性虫体,第1号染色体的短臂可见到一异染色质块。第2号性染色体的Z染色体不易出现C带,而W染色体从着丝点部位向长臂方向恒定的出现一大块异染色质。第3号、5号染色体不是恒定的出现C带。第4号染色体的端着丝粒非常明显。第6号、7号染色体在长臂末端分别可以见到一对异染色质块。在雄性虫体,可清楚地见到第2号性染色体为同形性染色体,两条同源染色体都没有异染色质出现。其它染色体的C带同雌性虫体。

血吸虫病原和宿主关系的研究 Ⅱ.萝卜螺感染东毕血吸虫等幼虫期的组织学和组织化学研究

在内蒙古呼伦贝尔草原牧场检获感染有斜睾总科吸虫幼虫期及其和土耳其斯坦东毕吸虫两种吸虫幼虫期双重感染的萝卜螺,对它们分别进行了组织学和组织化学观察。斜睾总科剑尾型尾蚴体壁皮层下及腹吸盘前各含有分泌酸性粘液及含糖类物质的单细胞腺体,在尾蚴成熟过程中,腹吸盘前标准阿新蓝阳性腺体分泌物逐渐排向体表最外层,体周皮层下分泌PAS反应阳性物质在其下形成不连续的一层。对保护尾蚴免受损伤,适应外界不良环境可能具有重要作用。在两种吸虫幼虫期双重感染的萝卜螺中,剑尾型尾蚴处于成熟前期,东毕吸虫则完全发育成熟,双重感染时寄生部位和各自单独感染一致,两种吸虫幼虫期在消化腺中各自成簇,呈镶嵌型分布,也存在迭加,但在不同的小区域内分布密度有所不同。双重感染的螺,其消化腺受到严重破坏,生殖腺几近消失,表明两种吸虫双重感染主要表现为对螺宿主提供有限空间和营养的竞争。

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因(TPI),鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接,构建重组表达质粒pPIC9k-TPI,并将其电击转化到毕赤酵母GS115中,重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白,经SDS-PAGE、western-blotting检测,并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示,成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43 ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种尾蚴穿刺腺的组织化学及超微结构观察

应用活体染色、组织化学染色及透射电镜观察和分析了土耳其斯坦东毕吸虫结节变种尾坳的腹吸盘腺体。经活体染色证实腹吸盘前腺含丰富的钙。前腺分泌颗粒在从基底部排出至虫体外过程中形态发生变化。腹吸盘后腺含有中性粘膜多糖及中性粘蛋白，其分泌颗粒在排出的过程中无变化。

土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因的克隆及其序列分析

目的利用RTPCR和RACE技术克隆土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因全长序列并进行序列分析。方法根据日本血吸虫和曼氏血吸虫肌动蛋白基因的保守区设计引物,利用RTPCR扩增出土耳其斯坦东毕吸虫的肌动蛋白基因的大片段,再结合RACE技术分别得到肌动蛋白的3’端和5’端,将三部分序列拼接后获得肌动蛋白基因的全长cDNA序列并进行序列分析。结果成功克隆了土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白的全长cDNA并提交GenBank,登录号为DQ017265,核酸序列比对表明东毕吸虫肌动蛋白基因的核苷酸序列和日本血吸虫、曼氏血吸虫的同源性分别为90%和91%。结论土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白的全长cDNA的克隆为进一步表达及其生物学性能的分析提供了理论基础。

东毕血吸虫中间宿主——淡水螺的研究

１９９４年在吉林省西北部牧区草原，对东毕血吸虫的中间宿主——淡水螺的种类、形态特征和活动规律进行了研究。结果证明，该地区的中间宿主是生活在各河流水系、泡沼的耳萝卜螺（Ｒａｄｉｘａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）和土蜗螺（Ｇａｌｂａｐｅｒｖｉａ）。在高温、高湿、降雨多的年份，淡水螺生长旺盛，感染率高。