osRACD基因表达与光敏核不育水稻光周期育性转换的相关性

为检测水稻低分子量GTP结合蛋白编码基因osRACD与光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换的相关性,用农杆菌介导转化和潮霉素抗性筛选获得了大量的转基因水稻植株。通过PCR、Southern杂交、RT-PCR和Northern检测等,证明反义osRACD基因和正义osRACD基因均已分别在转基因农垦58N和58S水稻植株的幼穗中得到了稳定的表达。成熟转基因植株的自交结实率统计分析表明,反义osRACD基因的表达大大降低了转基因58N水稻植株的育性,其平均结实率明显低于对照植株;而正义osRACD基因在转基因58S水稻植株的幼穗中表达后,使得长日下生长的、本来不育的58S植株的育性得到一定程度上的恢复,有的植株的结实率还高于短日下生长的对照植株;而且,osRACD基因表达水平越高的转基因58S植株,其对应的结实率也越高。降低幼穗中内源osRACD基因的表达水平会导致转基因58N水稻植株的育性降低,恢复长日下生长的转基因58S水稻植株幼穗中osRACD基因的表达,则可恢复其育性。这表明,osRACD基因的表达参与了农垦58S光周期育性转换的调控过程。这是第一个报道的参与光信号传导与光敏核不育水稻光周期育性调控的低分子量GTP结合蛋白的编码基因。

水稻osRACD基因编码蛋白质的生化特性分析

将控制光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换特性的发育调节相关基因osRACD克隆在原核表达载体pET28a(+)上,构成重组质粒pET-racd,并转化给大肠杆菌BL-21,提取转化子菌株的蛋白质,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和凝血酶因子的切割作用,最终获得了单一的osRACD蛋白。此蛋白质经过超滤浓缩和谷胱甘肽氧化还原体系的复性作用之后,供作体外功能鉴定。结果显示,在大肠杆菌BL-21转化子菌株中表达的osRACD蛋白,具有与GTP特异结合及水解GTP的活性。

转水稻osRACD反义基因拟南芥植株的育性分析

利用反义RNA技术,将水稻低分子量GTP结合蛋白基因osRACD反向置于CaMV35S启动子的调控下,构成反义基因表达载体pBID,并用真空渗透法转化拟南芥植株,转基因植株的荚果自花谢之后就停止生长,其后荚果便自顶端开始逐渐枯黄并死亡;而对照植株的荚果在花谢之后仍继续生长直到成熟。花粉离体萌发生长实验显示,转基因植株花粉萌发后的生长延伸过程受到抑制,形成短而略粗的花粉管;而对照植株花粉萌发后的生长状况正常,形成长圆柱形的花粉管。这些结果表明,osRACD基因的功能是参与控制花粉管的生长延伸过程,其编码的蛋白质可能是调控光敏核不育水稻58S育性的重要因子之一。

水稻OsRacD与OsRhoGDI2基因共表达载体的构建

水稻OsRacD是从水稻幼穗中分离的Rho基因,OsRhoGDI2是通过酵母双杂交筛选到的与OsRacD相互作用蛋白的编码基因,已有的研究表明OsRacD与OsRhoGDI2之间可能存在相互作用,并参与水稻育性调控过程.为了鉴定二者的相互作用,本研究构建了OsRacD与OsRhoGDI2基因共表达载体,为采用免疫共沉淀验证二者在体内的相互作用,解析OsRacD与OsRhoGDI2基因参与水稻育性控制的分子机制奠定了基础.