绿豆窄叶突变体vrnl11的精细定位

绿豆叶形突变体和叶形调控基因的鉴定,可为品种叶形的遗传改良提供种质资源,也有利于解析叶片发育的遗传调控机理。从皖科绿3号EMS诱变突变体库中筛选到窄叶突变体vrnl11,利用vrnl11/皖科绿3号和vrnl11/中绿1号的杂交后代进行遗传分析,用χ^(2)检验确定F_(2)群体中不同表型植株的分离模式。以vrnl11和中绿1号及中绿5号构建的2个F_(2)群体为定位群体,利用BSA测序技术和图位克隆的方法完成vrnl11的精细定位。表型鉴定结果表明,vrnl11叶片宽和叶面积较野生型皖科绿3号分别减少25.7%和21.7%。遗传分析表明,vrnl11的窄叶表型受单隐性核基因调控。BSA测序分析将突变位点定位在第11染色体上15.0 Mb至末端4.7 Mb的区间内。利用新开发的多态性分子标记将vrnl11定位在标记nl-61和nl-46之间186.5 kb的区间内,包含9个预测基因。这些研究结果为克隆vrnl11和解析绿豆叶片生长发育的分子调控机理提供理论依据。

水稻D1基因新等位突变体的鉴定与功能分析

[目的]株高是作物重要的农艺性状,挖掘株高控制基因并解析其分子功能,可为作物高产育种提供更多有用的基因资源。[方法]利用EMS诱变水稻日本晴获得的矮化突变体d1-11为材料,进行表型和细胞学观察,通过图位克隆的方法鉴定d1-11基因并对基因表达、激素含量和抗旱性进行了分析。[结果]d1-11突变体表现出植株矮化、叶片变短变宽和籽粒形态变圆表型;d1-11突变体叶片中脉萎缩,大脉和小脉数量和面积减少,导致叶片形态变异。d1-11基因被定位到水稻5号染色体R5M15.2和R5M15.8两个分子标记之间;图位克隆结果表明d1-11突变体中D1基因第11外显子和内含子交界处单碱基替换导致基因功能缺失。D1基因在苗期各组织中表达量较高,从分蘖期开始表达量降低;外源脱落酸(ABA)处理24 h后诱导D1基因表达,外源赤霉素(GA)处理抑制D1基因表达,盐胁迫处理24h诱导D1基因剧烈上调表达。d1-11突变体植株GA、油菜素内酯(BR)和生长素(IAA)等激素含量均上升,叶片相对含水量上升、叶片失水速率降低,植株对干旱胁迫抗性显著增强。[结论]鉴定到水稻D1基因新等位突变d1-11,发现d1-11突变体多种内源激素水平上升、叶片含水量增加、植株对干旱胁迫抗性增强。本研究进一步丰富了水稻矮化基因资源并揭示D1基因新的生物学功能。

水稻中花11辐射突变体的分离与鉴定

利用伽玛射线对粳稻品种中花 11进行辐照 ,以诱导广泛的形态突变体 ,为水稻功能基因组研究提供基础材料。辐射第 1代单本移栽并实行单株收获 ;辐射第 2代 (M2 )播种 1万个家系 ,自苗期开始至成熟期各个生育阶段从中独立选获各类形态突变体 5 40个 ;经M3 复选获得包括叶、茎、穗和育性变化等各类突变体 431份。统计结果表明 ,形态性状的突变频率为 5 .1%。

水稻93-11 EMS诱导突变体的分离与鉴定

利用EMS对籼稻品种93-11进行诱变处理,以构建基因突变群体。M1单本移栽并单株收获。M2播种5000个家系,根据各个生育阶段表现鉴别出411个家系发生了形态突变,并收获271个家系。M3代对M2代收获材料按照系谱法进行跟踪观察和验证。结果表明,形态性状的突变频率为8.22%。其中一些突变体具有优良农艺性状,有可能在育种中得到利用。

芒果MiRab11基因及突变体的原核表达分析

为研究芒果MiRab11蛋白的互作及其它生物学功能,本文在MiRab11基因序列基础上,采用重叠PCR定点突变技术,获得了2个结构域突变体Mi-Rab11CA和Mi-Rab11DN,将其构建原核表达载体,并成功转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE结果显示,在28℃条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导4 h,可获得大量可溶性蛋白的表达。将可溶性蛋白经Ni-NTA argrose层析柱纯化并western blot鉴定,该重组蛋白均可与抗His单克隆抗体发生特异性免疫反应。本研究为深入研究芒果pET-Rab11蛋白生理活性、特异性结合位点及功能调控打下良好基础。

(A11,A12)胰岛素原移位突变体的表征研究

将(CysA11Ser,SerA12Cys)人胰岛素原移位突变体基因克隆至高效表达质粒pET22b多克隆位点区,构建重组表达质粒pET-A112,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLys中进行了表达.表达产物存在于包涵体中,通过包涵体的分离及二硫键变复性,获得A6-A12二硫键突变型的胰岛素原突变体.SDS-PAGE电泳显示突变型胰岛素原的电泳迁移率与野生型胰岛素原基本相同.质谱检测表明,突变性胰岛素原的分子结构均一、纯度良好,氨基酸组成与理论值基本一致.以野生型人胰岛素原为对照进行的胰岛素受体试验及胰岛素放射免疫试验表明,A6-A12二硫键错接型胰岛素原突变体的受体结合活性和放免活性是野生型胰岛素原的11%与55%.

亚低温对番茄hta9hta11双突变体光合碳同化相关指标的影响

表观遗传机制可调控植物对逆境胁迫的应答,组蛋白变体H2A.Z为重要的表观修饰因子,参与多种非生物胁迫[1-3],并且,其基因家族成员较多[4-5]。hta9hta11双突变体植株具有多效性表型,且H2A.Z基因家族其他成员的表达不能补偿HTA9 和HTA11 蛋白功能缺失[6]。

水稻成花素家族OsDTH11基因的CRISPR/Cas9编辑突变体的创制

水稻成花素家族基因在水稻的开花结实过程中发挥重要作用。水稻基因组中共有19个成花素相关基因,其中Hd3a和RFT1基因已被证实能够促进水稻抽穗开花,其余成花素成员功能未知。本文针对水稻成花素家族成员OsDTH11基因,基于CRISPR/Cas9技术构建了基因编辑载体,并通过农杆菌介导的遗传转化方法成功获得了该基因的敲除突变体。经测序验证发现了2种类型的突变体,一种是纯合的62 bp缺失突变体,另一种是31 bp缺失的杂合突变体。通过自交分离分别获得两种类型稳定遗传的纯合突变体材料,为OsDTH11基因的生物学功能与水稻开花分子机制研究奠定了基础。

利用CRIS PR/Cas9技术创制水稻中花11号dwarf1突变体

【目的】水稻异源三聚体G蛋白α亚基在植物生长与逆境应答中具有重要的生物学功能,在水稻中花11号品种中创制Gα蛋白编码基因DWARF1(D1)的突变体,为水稻功能基因组学研究提供材料。【方法】在中花11号的D1基因座位上设计靶向其外显子的sgRNA序列,构建CRISPR/Cas9载体,转化中花11号胚愈伤组织,经过抗性愈伤组织筛选和诱导分化后,对再生植株进行鉴定。【结果】筛选到3个含有不同编辑形式的d1突变株系,实时荧光定量PCR分析发现,D1 mRNA水平显著降低,表明无义突变介导的D1 mRNA降解过程亦被触发。在3个d1突变株中进一步鉴定到不含潮霉素抗性基因、不含载体骨架的植株,繁育后可以得到无转基因痕迹、稳定遗传的d1敲除植株。对d1突变株的生长、发育情况进行观察发现,中花11号背景下d1突变株显著变矮、穗明显变小,株高和穗长为中花11号野生型的50%~60%。种子变小及变圆,同时,种子长宽比和千粒重降低约40%。【结论】获得有效移码突变的中花11号背景d1突变株系,为进一步研究G蛋白及其相关基因的功能创制遗传材料。

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11(ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T0代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T2代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T2后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。

水稻类树状突变体pla1-5的鉴定与基因克隆

在粳稻品种台北309经60 Co-γ辐射诱变的后代中发现了一份类树状突变体pla1-5,该突变体表现为植株矮化、叶片小且数量增多、分蘖数减少、高位分蘖、穗分化受阻等特征。遗传分析表明,该性状受一对隐性核基因控制。利用图位克隆技术将目的基因定位在第10染色体长臂上两个分子标记CHR1027和CHR1030之间,物理距离为58kb,并与SSR标记CHR1028和CHR1029共分离。根据水稻基因组序列的注释,该区域内存在5个完整的预测基因。测序分析表明pla1-5突变体中一个编码细胞色素P450CYP78A11的释义基因LOC_Os10g26340第1外显子内缺失了一个碱基T,导致移码突变和翻译提前终止。据此,初步推测细胞色素P450CYP78A11基因为PLA1-5的候选基因。

α-突触核蛋白的突变体A53T对小胶质细胞激活的影响

目的:探究重组人的野生型α-突触核蛋白(wild type alpha-Synuclein,WTα-Syn)和重组人的α-突触核蛋白突变体A53T(α-Synuclein mutant A53T,α-Syn A53T)对原代小胶质细胞的影响。方法:无菌培养原代小胶质细胞,细胞静息状态下加药处理,通过免疫荧光染色观察小胶质细胞的形态和Western Blot半定量分析CD11b的变化。结果:高浓度的WTα-Syn可以激活小胶质细胞;CD11b蛋白表达量明显升高;而2μmol/L和5μmol/L的α-Syn A53T均能激活小胶质细胞,CD11b蛋白表达量均升高。结论:相同浓度的WTα-Syn和α-Syn A53T,α-Syn A53T更容易激活小胶质细胞。

水稻愈伤诱导过程中生长素通路的初步研究

构建水稻LBD基因家族中CRL1基因的CRISPR/CAS9基因敲除载体,并转化中花11水稻愈伤,获得了8个转基因片段缺失家系;对CRL1基因敲除材料种子进行愈伤诱导实验;结果显示,它们的愈伤组织诱导受到了强烈抑制,与已知的水稻OsIAA10基因的RNA干扰材料表型相似。进行OsIAA10的亚细胞定位实验,结果显示,OsIAA10同时定位在细胞核与细胞膜上。通过酵母双杂交筛库实验,发现OsIAA10能与OsARF家族成员中的OsARF5、OsARF1、OsARF721、OsARF23四个转录因子发生互作。以CRL1基因启动子为诱饵构建载体,进行酵母单杂交点对点实验,结果显示,这4个转录因子中只有OsARF5与OsARF21能特异性结合CRL1基因启动子区的AuxRE基序,激活CRL1基因转录。本研究结果初步证明水稻侧根发育通路与愈伤组织诱导过程存在直接相关,水稻与双子叶植物之间存在保守的生长素调控机制,在水稻种子的愈伤组织诱导过程中发挥着重要的作用。

丹参酮生物合成途径中C20位氧化酶改造研究

丹参酮类化合物是丹参主要有效成分之一,在心血管类疾病治疗中发挥重要作用,丹参酮类化合物的微生物异源生产能够为含丹参中药制剂生产提供大量原材料,降低提取成本,缓解临床用药压力。丹参酮生物合成途径包含多个P450酶,高效优势的催化元件是丹参酮微生物生产的基础,该研究以丹参酮途径关键P450-C20位羟化酶CYP76AK1为研究对象,使用SWISS-MODEL、Robetta和AlphaFold2这3种蛋白建模方法,对所得蛋白模型进行分析,获取可靠蛋白结构,以分子对接和同源比对进行突变体蛋白的半理性设计。筛选发现了影响CYP76AK1氧化活性的关键氨基酸位点,通过真核表达对所得突变体进行体外功能研究。研究获得了对11-羟基柳杉酚具有连续氧化功能的CYP76AK1突变体元件,解析了影响其氧化活性的4个关键氨基酸位点,并根据突变结果分析3种蛋白建模方法的可靠性。研究首次报道了丹参中CYP76AK1的有效蛋白改造位点,为丹参酮类化合物合成生物学研究提供了C20位不同氧化活性的催化元件,为解析C20位修饰P450蛋白的连续氧化机制奠定基础。

虎纹捕鸟蛛Kunitz型毒素基因的分子改造和表达

目的构建HW11c40突变体,寻找合适的表达系统表达HW11c40突变体和HWTX-XI(虎纹捕鸟蛛毒素-XI),解决HWTX-XI来源问题和HW11c40改造后毒素难于获取的难题,为合适HW11c40突变体的筛选和治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定基础。方法用PCR定点突变的方法突变HW11c40相关氨基酸残基,构建HW11c40突变体。HW11c40突变体和HWTX-XI基因经PCR扩增后插入到pET-40b(+)载体,基因5'端插入肠激酶切割位点,再重组到大肠埃希菌BL21(DE3)进行原核周质表达,获得相应的融合蛋白并进行SDS-PAGE鉴定,用镍柱纯化融合蛋白。融合蛋白用肠激酶酶切,释放出的目的蛋白用Tricine-SDS-PAGE进行鉴定,用镍柱分离目的蛋白,进行高效液相色谱进行进一步分离纯化后作质谱鉴定。对HW11c40突变体和HWTX-XI的表达时间、温度和IPTG浓度进行优化。结果成功获得HW11c40的4个突变体,并正确构建HW11c40突变体和HWTX-XI的原核表达载体。经SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE鉴定,重组质粒转化菌在无IPTG诱导的情况下成功表达所有HW11c40突变体和HWTX-XI的融合蛋白,经肠激酶酶切均获得对应的目的蛋白,其中HWTX-XI表达量为3.4mg/L。结论成功构建出HW11c40突变体和HWTX-XI的重组质粒并在原核细胞内高效表达出相应的目的蛋白,开辟了基因工程表达HWTX-XI的新途径,同时解决了HW11c40改造后毒素获取难题,突破了整个系列研究的瓶颈,为突变体的筛选及治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定了基础。

大豆子粒蛋白亚基变异种质的鉴定与筛选

本研究以大豆优良品种中品661的298份甲基磺酸乙酯(EMS)诱变株系和610份大豆品种(系)为试验材料,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,分离大豆种子蛋白并计算各蛋白亚基的相对含量及11S/7S值。研究结果表明,突变群体与自然群体中不同亚基的变异系数差异极显著,但均以β亚基变异范围最大。另外,突变群体的α、β和酸性蛋白亚基的变异范围均大于自然群体。相关性分析显示:11S球蛋白与7S球蛋白含量呈极显著负相关;11S/7S值与蛋白含量相关性不显著,11S/7S值与11S和7S球蛋白各组成亚基均呈显著相关。此外,本研究还筛选出亚基明显变异材料6份,其中Ax亚基突变体尚未见报道,11S/7S值大于3的材料10份,蛋白含量大于48%的材料7份。本研究鉴定和筛选的种子蛋白变异种质为大豆品质相关基因发掘和品种改良提供了材料基础。