骨髓间充质干细胞分化的成骨细胞支持脐血造血干祖细胞的研究

本研究利用骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞构建二维培养体系,探讨其体外支持脐血干/祖细胞生存的作用。体外进行人骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养后诱导为成骨细胞,构建二维培养体系。将免疫磁珠分选的CD34+脐血干/祖细胞接种于其中,在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,进行CFU,HPP-CFU和LTC-IC测定并将其分别与MSC、成骨细胞,MSC/成骨细胞(1∶2)作为饲养细胞的二维培养体系实验结果相比较。结果发现:在所构建的造血干/祖细胞(HSPC)二维培养体系中,骨髓MSC诱导成骨细胞对于脐血造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系,尤其对长期造血干细胞(longterm-HSC)体外生存有更为明显地支持作用。结论:骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞构建的二维体系对于脐血干/祖细胞体外培养具有支持作用,进一步证实成骨细胞对造血干细胞生存与增殖具有重要调控作用。

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bonemarrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法。方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～20mL,全骨髓10%FBS DMEM培养液进行原代培养。将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代。对细胞形态特征进行观察;行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质。结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长。诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性;经成骨细胞诱导培养14d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性。结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。

人骨髓源性成骨细胞体外培养和生物学特性的研究

目的研究人骨髓源性成骨细胞的生物学特性,为骨组织工程选择理想的种子细胞提供依据。方法采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,传代扩增后采用诱导培养基进行诱导,对骨髓基质干细胞诱导成的成骨细胞进行细胞形态学观察,检测碱性磷酸酶活性及分泌钙结节和I型胶原的能力。结果骨髓基质干细胞可以进行传代和大量扩增,经诱导培养后能够诱导出成骨细胞,诱导出的成骨细胞具有典型成骨细胞的形态学和生物学特性。结论骨髓源性成骨细胞具有良好的成骨细胞特性,可以作为骨组织工程的种子细胞。

转录调控因子CBF1(RBP-Jκ)对Cbfa1和Ose2元件启动子活性的影响

目的探讨Notch信号转录调控因子CBF1(RBP-Jκ)对核心结合因子Cbfa1基因启动子和骨钙素基因启动子区域Ose2元件启动子活性的影响。方法构建CBF1真核表达载体pCMV-Tag4/CBF1;将梯度浓度pCMV-Tag4/CBF1和荧光素酶报告质粒共转染两成骨前体细胞系Kusa-A1和Kusa-O,用双荧光素酶报告基因方法检测Cbfa1和Ose2元件启动子活性。结果随CBF1浓度增加,Kusa-A1和Kusa-O细胞中Cbfa1和Ose2元件启动子活性均逐渐提高。统计分析表明Kusa-A1细胞中1/40μg/μL实验组两启动子活性均与对照组差异显著;Kusa-O细胞中1/40μg/μL实验组Ose2元件启动子活性与对照组差异显著。结论转录调控因子CBF1可以促进Cbfa1和Ose2元件启动子活性,从而可能对细胞的成骨性分化有正调节作用。

低氧环境中微囊化成骨细胞支持造血干/祖细胞扩增

在模拟骨髓造血壁龛(hematopoietic niche)的氧分压条件下,探讨微囊化成骨细胞(osteoblasts,OB)对脐血造血干/祖细胞(HSPC)体外扩增的支持和调控机理.分离培养人髂骨OB,采用聚电解质络合法将第3代的OB以密度为8×105ml包埋在直径为0.5mm的明胶-海藻酸钠-壳聚糖(GAC)微胶珠中.将微珠+造血干/祖细胞(A′组)、造血干/祖细胞(B′组)及微珠(C′组)置于6孔板,在5%氧分压下进行培养.同时在20%常氧条件下设置同样分组培养作为对照(A,B,C).通过流式细胞分析和半固体细胞集落培养,观察比较各培养体系中造血干/祖细胞的扩增,并检测体系内白血病抑制因子(LIF)和白介素-6(IL-6)的含量变化以探讨作用机理.经过倒置相差显微镜观察,人成骨细胞在微珠中分散均匀,生长状态良好.微珠内部有丰富的孔道供营养物质传递,有大量造血干/祖细胞弱黏附于微珠表面.经过7天的培养,A′、B′、A、B四组造血细胞的扩增倍数分别为(49.0±4.6),(3.3±0.5),(17.7±1.2)和(1.9±0.2).A′、B′、A组的CD34+细胞分别扩增了(87.6±8.3),(2.2±0.3)和(14.9±1.0)倍,B组则出现下降.A′、B′、A、B四组CFU-Cs集落扩增倍数分别为(9.8±0.8),(3.5±0.4),(6.9±0.7)和(2.6±0.2).低氧共培养体系比常氧共培养体系和非共培养体系对造血干/祖细胞的扩增有更大的促进作用.A′、B′、C′中IL-6和LIF含量明显高于对应的A、B、C组,与扩增倍数的差异相对应.微囊化成骨细胞对造血干/祖细胞扩增有明显的促进作用,5%氧分压接近体内造血壁龛氧环境,在此环境中成骨细胞分泌细胞因子量增多并通过其对造血干/祖细胞的扩增进行调节.

人骨髓基质干细胞体外诱导和鉴定

目的建立人自体骨髓基质干细胞(human menchymal stem cells,hMSCs)体外分离、鉴定体系,建立经诱导表达成骨、软骨、脂肪细胞表型的体外培养体系,探讨作为骨组织工程种子细胞的可能性,为组织工程技术应用打下基础。方法抽取患者骨髓5ml,以密度梯度法分离hMSCs,使用流式细胞仪鉴定细胞表型;应用免疫组化和分子生物学技术,对hMSCs进行成骨、软骨、脂肪细胞的诱导培养和表型鉴定。结果第2代hMSCs阳性细胞表达率CD105(78±6)%,CD166(43±7)%,CD29(69±12)%;hMSCs成骨诱导培养第3代平均扩增(163.4±13.4)倍,形成钙结节,骨细胞转录因子、骨钙素、骨桥蛋白和I型胶原免疫荧光阳性,RT-PCR证实有I型胶原、骨钙素、骨桥蛋白和骨结合素mRNA表达,对照组阴性;成软骨细胞诱导培养后II型胶原、SOX9(SRY-type HMGbox9,是在哺乳动物性别决定和软骨生成中起着关键调控作用的一个基因)。免疫荧光阳性,RT-PCR证实II型胶原、软骨聚集蛋白聚糖mRNA表达,对照组阴性;成脂肪细胞诱导培养后,油红-O染色阳性,RT-PCR证实PPAR2 mRNA的表达,对照组阴性。结论通过密度梯度法可获得较高纯度hMSCs,经体外培养能保持多项分化潜能,体外诱导培养第3代仍可表达各种细胞表型,能够满足骨组织工程临床应用对种子细胞质和量的需要。

兔骨髓间质干细胞的成骨诱导及鉴定

目的 :探讨体外成骨诱导的兔骨髓间质干细胞 ( MSCs)的形态和功能特征 ,以及其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法 :选用生长状态良好的兔骨髓间质干细胞 ,在体外进行成骨活性诱导 ,并进行形态学观察和碱性磷酸酶、骨钙素的测定。结果 :经过体外成骨诱导的兔 MSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征 ,同时在刺激 1周后表达碱性磷酸酶活性 ,在结节期和矿化期表达骨钙素活性。结论 :体外成骨诱导的的兔 MSCs具有典型的成骨细胞的阶段性特征和功能性特征 。

探讨电磁场影响骨髓间充质干细胞增殖分化的时间依赖性

目的探究正弦波电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨方向分化、促进其增殖的时间依赖性。方法用差速贴壁法分离培养(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs),取用生长状态良好的第三代细胞进行实验。将细胞按照1×105个/孔接种于3.5 cm细胞培养皿中。将细胞培养皿按照完全随机分组的原则分为实验组与对照组,每组分别设有1 d组、4 d组、7 d组、10 d组、14 d组共五个亚组。将实验组置于15 Hz 1 mT正弦波电磁场中每天暴磁1 h,对照组在同条件无磁场的细胞培养箱中培养。暴磁结束后提取各组细胞总RNA,用荧光定量PCR方法检测比较各组中成骨指标:RUNX2、碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液酸蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)基因相对表达量的变化趋势。另有一批细胞按照1×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,每块细胞培养板设7个副孔,共接种10块细胞培养板。按照完全随机分组原则,随机分组为实验组与对照组,每组分别设有1 d组、4 d组、7 d组、10 d组、14 d组共五个亚组。将实验组置于15 Hz 1mT正弦波电磁场中每天暴磁1 h,对照组在同条件无磁场的细胞培养箱中培养。用CCK8法检测比较各组细胞增殖情况。结果电磁场作用骨髓间充质干细胞的早期阶段(1 d、4 d)可以诱导其向成骨方向分化,而在其作用的晚期阶段则抑制其进一步成骨方向分化;相应的电磁场作用初期抑制大鼠骨髓间充质干细胞增殖,电磁场作用后期可促进其增殖,尤其在7 d、10 d时效应明显。结论电磁场可以影响大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨方向分化,并且这种影响具有时间依赖效应。

人脐带间充质干细胞来源的外泌体促进小鼠成骨前体细胞增殖与分化

目的提取人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)来源的外泌体(hucMSC-exo),观察其对小鼠成骨前体细胞(mouse osteoblast progenitor cells,mOPCs)的作用。方法体外分离培养hucMSCs,超速离心法收集外泌体;采用CCK8试剂盒检测不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs增殖的影响,碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色观察不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs矿化的影响。结果成功提取hucMSCs,呈现旋涡状贴壁式生长,形态呈长梭形,具有多向诱导分化潜能。HucMSCs来源的外泌体呈圆形、椭圆形,大小在80 nm左右最多,阳性表达CD9,CD63。CCK8法结果显示5、10μg/ml的hucMSC-exo可以显著地促进mOPCs在体外的增殖(P<0.05),碱性磷酸酶和茜素红染色结果发现5、10μg/ml的hucMSC-exo组可以明显提高mOPCs碱性磷酸酶活性及钙化结节的形成,且10μg/ml的外泌体浓度作用强于5μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功提取了hucMSCs及hucMSC-exo,hucMSC-exo可以以浓度依赖的方式促进mOPCs的增殖与成骨分化。

人成骨样细胞和前破骨样细胞ER亚型、OPG/RANKL/RANK系统、IL-6及其受体以及破骨细胞标志基因表达的研究

目的分析比较两种人成骨样细胞系(U2-OS、MG-63)和两种人前破骨样细胞系(U937、HL-60)ER亚型、OPG/RANKL/RANK系统、IL-6及其受体以及破骨细胞标志基因表达的差异,为今后研究雌激素与IL-6等细胞因子在骨组织中相互关系提供适宜的细胞模型。方法RT-PCR和免疫印迹法检测ERα、ERβ的表达,ELISA法测定IL-6的分泌,OPG、RANKL、RANK及IL-6受体的表达采用免疫印迹法进行检测,TRAP、MMP-9则采用RT-PCR技术进行分析。结果(1)转录水平及蛋白水平证实四种细胞均表达ERα和ERβ;(2)四种细胞不同程度地表达OPG和RANKL,而RANK则仅见于U937细胞表达;(3)四种细胞均表达IL-6受体(IL-6Rα、gp130),除U2-OS细胞外其余三种细胞均组成型分泌IL-6;(4)破骨细胞标志基因TRAP在两种人前破骨样细胞U937、HL-60中均表达,且表达水平相近;而MMP-9仅在U937细胞中弱表达;两种人成骨样细胞U2-OS、MG-63未见有这两种基因表达。结论筛选出用于研究雌激素与IL-6等细胞因子在骨组织中相互关系的细胞模型,同时也为今后深入阐明骨靶向和其他新型抗骨质疏松雌激素的分子机制研究奠定基础。

骨髓增生异常综合征患者源成骨细胞表达多种细胞因子并体外维持造血祖细胞存活

为了解骨髓增生异常综合征(MDS)患者成骨细胞的生物学特性,并探讨其对体外造血的支持能力,利用骨髓间充质干细胞多向分化潜能将其诱导分化为成骨细胞,在体外和造血细胞构建二维培养体系,研究其体外支持造血祖细胞生存的作用;同时采用RT-PCR的方法在mRNA水平上分析由骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞细胞因子的表达并与人成骨细胞系hFOB1.19比较。结果发现,来源于MDS患者的成骨细胞在无外源性细胞因子的条件下能够短期维持GM-CFC造血祖细胞的存活。经过RT-PCR证实,人成骨细胞系hFOB1.19表达SCF、IL-6、SDF-1α、G-CSF、GM-CSF等细胞因子,来源于MDS患者和正常人的成骨细胞也能表达上述细胞因子,但却不表达GM-CSF。结论:与正常人相比,MDS患者源的成骨细胞同样能够维持GM-CFC的存活,这可能和成骨细胞表达多种重要的造血相关的细胞因子有关。

成骨前体细胞对乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响

目的通过共培养体系探讨成骨前体细胞MC3T3-E1对MDA-MB-231乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响。方法实验组将MC3T3-E1及MDA-MB-231细胞采用transwell小室共培养,上室接种MC3T3-E1成骨细胞,下室接种相同数量的MDA-MB-231细胞。对照组上、下室均采用相同数量及密度的MDA-MB-231细胞。实时荧光定量PCR、Western blot法检测实验组及对照组骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的基因及蛋白的表达差异,采用CCK-8法检测各组增殖的差异,结晶紫染色法检测细胞集落形成差异。结果与对照组相比,实验组OCN、OPN、OPG的基因及蛋白表达均有明显的上调(P<0.05),MDA-MB-231细胞的增殖能力明显增高(P<0.01);实验组MDA-MB-231细胞集落形成数量及大小均优于对照组。结论短期共培养后MC3T3-E1成骨细胞可促进乳腺癌MDA-MB-231细胞表达骨拟态特性,并可促进其增殖及细胞集落形成。

内皮祖细胞条件培养基对脂肪干细胞成骨分化的影响

目的探究SD大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)条件培养基(EPC-CM)对脂肪间充质干细胞(ADSCs)增殖和成骨分化能力的影响。方法体外分离、培养、扩增并鉴定SD大鼠ADSCs与EPCs。实验设置3个不同浓度的EPC-CM培养ADSCs,分别为对照组(不含EPC-CM)、50%EPC-CM组和100%EPC-CM组。采用CCK-8检测各组ADSCs的增殖活性;采用茜素红及碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红染色定性检测各组ADSCs的成骨分化能力;使用ALP及钙离子定量检测比较各组ADSCs成骨分化能力。结果免疫荧光检测提示ADSCs高表达表面特异性蛋白CD90,且经诱导可向成骨、成软骨和成脂方向分化。第2代EPCs高表达CD133和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2);在铺有基质胶的96孔培养板中可形成管腔样结构,能够特异性地摄取乙酰化低密度脂蛋白和FITC-UEA-1。与对照组相比,50%EPCCM组和100%EPC-CM组ADSCs增殖活性均明显增加,且与EPC-CM浓度相关(P<0.05)。ALP定量检测培养14 d及21 d后50%EPC-CM组和100%EPC-CM组ADSCs的ALP活性均高于对照组(P<0.05)。培养14 d和21 d后,50%EPC-CM组和100%EPC-CM组钙离子含量均高于对照组(P<0.05)。结论 EPC-CM能够促进ADSCs的增殖与成骨分化能力,为阐明血管化细胞影响骨形成的机制提供了一定依据。

Nel样分子1型蛋白在脊柱融合术后促进骨性融合的作用与机制

背景:在脊柱融合术中进行充分植骨是非常必要的,然而,老龄患者自身成骨细胞数量有限和骨微环境改变以及骨形态发生蛋白2体内应用会引起例如异位骨等不利影响,导致目前的治疗方法会引起骨不连和其他并发症。在此情况下,Nel样分子1型(Nel-like type 1 molecular,Nell-1)进入研究人员的视野,Nell-1不仅在成骨活性上与骨形态发生蛋白2相当,而且具有抗脂肪、抗炎、促血管化的特性,这为Nell-1促进脊柱融合的临床试验批准奠定了基础。目的:综述Nell-1促进脊柱融合术后骨性融合中的作用及机制。方法:由第一作者检索百度学术、PubMed、Web of Science、万方及中国知网收录的相关文献,中文检索词为“Nell-1、脊柱融合、骨性融合、前成骨细胞分化、新生血管、祖细胞迁移”,英文检索词为“Nell-1;spinal fusion;bone fusion;pre-osteoblast differentiation;neovascularization;progenitor cell migration”,最后纳入68篇文献进行综述。结果与结论:自体骨移植存在植骨相关并发症以及来源不足等问题,而且以骨形态发生蛋白2为代表的骨移植替代治疗会产生许多非靶点效应,因此两者都不能满足日益增加的脊柱融合术的需求。在此背景下,Nell-1的出现为解决这种困境提供了可能。虽然Nell-1在脊柱融合术后促进骨性融合的作用还处于初级研究阶段,仍然存在缺乏最佳给药途径、分子机制不完全清楚、是否存在与应用相关的不良反应等不足,但其具有促进祖细胞迁移、前成骨细胞分化以及新生血管形成等特点,因此对于促进脊柱融合术后骨性融合具有巨大的潜力。未来的研究应进一步揭示详细的潜在机制、优化剂量和方案、探索与其他成骨生长因子及干细胞的联合应用,将Nell-1促进脊柱融合的潜力转化为临床实践。

人间充质干细胞外泌体通过p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路促进小鼠胚胎成骨细胞前体增殖和成骨分化

目的观察人间充质干细胞(hMSC)分泌的外泌体对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)增殖和成骨分化的作用,并基于p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路探讨相关分子机制。方法采用流式细胞术检测hMSC表面标志物;以成骨诱导液干预hMSC,通过茜素红染色检测钙化结节以反映其成骨能力;采用差速离心法提取hMSC外泌体,通过电镜观察检测外泌体粒径。将MC3T3-E1细胞分为4组,分别给予外泌体干预(外泌体组)、p38MAPK抑制剂SB203580干预(抑制剂组)、SB203580干预6 h后再加入外泌体干预(抑制剂+外泌体组),以未干预组作为对照组。通过蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR检测各组细胞中Ⅰ型胶原蛋白alpha1(COL1A1)、ruh相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(Alp)、骨桥蛋白(Opn)的蛋白和mRNA表达量,蛋白质印迹法检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的表达量,MTT法检测细胞增殖情况,茜素红染色检测细胞成骨能力,采用Alp试剂盒检测细胞上清液中Alp活力。结果 hMSC表面CD90和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达;hMSC具有成骨分化能力;分离的外泌体粒径为40 ~ 160 nm。与对照组比较,外泌体组MC3T3-E1细胞增殖能力,成骨能力,Alp活力,细胞中COL1A1、Runx2、Alp、Opn的蛋白和mRNA表达量,p-p38/p38MAPK蛋白表达量比值均增高,差异有统计学意义(P < 0.05);抑制剂组结果与外泌体组相反,与对照组比较,差异均有统计学意义(P < 0.05);与抑制剂组比较,抑制剂+外泌体组MC3T3-E1细胞增殖能力、矿化结节、Alp活力无明显变化,细胞中COL1A1、Runx2、Alp、Opn的蛋白和mRNA表达量及p-p38/p38MAPK蛋白的表达量比值均无明显变化,差异无统计学意义(P > 0.05)。结论 hMSC分泌的外泌体可通过p38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化。

冠状动脉钙化与成骨细胞表型的内皮祖细胞相关性

目的：探讨冠状动脉钙化与表达成骨细胞表型的内皮祖细胞（EPC-OCN）含量的关系。方法：收集上海新华医院行冠状动脉CT血管造影的患者48例，以钙化积分（CACS）定量评估冠脉钙化程度。其中冠状动脉无明显或轻度钙化的记为轻、中、重度钙化组。流式细胞术分析以CD34、KDR和OCN抗体所标记外周血单个核细胞中的EPC数量及EPC-OCN含量。结果：轻度钙化组EPC数量较中度及重度钙化组明显增多；重度钙化组表达EPC-OCN比例显著高于轻、中度钙化组；3组EPC-OCN数量无显著差异；多因素回归分析显示，EPC数量与钙化积分呈负相关；而EPC-OCN比例与钙化积分、血磷浓度、空腹血糖、糖化血红蛋白呈正相关。结论：冠状动脉钙化患者循环EPC数量减少，与钙化积分呈负相关；冠状动脉严重钙化患者EPC-OCN比例升高，并与钙化积分、血磷浓度、空腹血糖和糖化血红蛋白呈正相关。

骨质疏松症与内皮祖细胞相关性研究进展

内皮祖细胞是具有多方向分化的潜能的细胞亚群,可分化为血管内皮细胞和成骨细胞,参与血管形成及骨的再生,其在疾病研究的运用也相当广泛。成骨系细胞凋亡是糖皮质激素性骨质疏松发生的生物学基础,而骨-血管耦联概念的提出,提示骨组织的血管发生与骨发生存在密切的交叉对话。基于血管与成骨系细胞方面对骨质疏松的重要性,以及内皮细胞的分化能力和对组织的修复能力,该文对骨质疏松症与内皮祖细胞相关性作一综述。

特种肽支架材料对骨髓基质干细胞黏附、增殖及成骨分化的影响

目的探讨新型含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽 K16RGDSPC 修饰聚丙交酯-CO-乙交酯(PLGA)-[ASP-PEG]支架材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)在其表面黏附、增殖及成骨分化的影响。方法固相合成法合成 K16GRGDSPC 并通过质谱仪和高压液相色谱进行鉴定。用交联剂Sulfo-LC-SPDP 将 K16GRGDSPC 接枝到 PLGA-[ASP-PEG]支架材料上,通过 XPS 图谱检测接枝反应的发生。将改性后的 PLGA-[ASP-PEG]支架材料与兔 BMSCs 在成骨诱导培养基中复合培养,以未改性的支架材料作对照。通过沉淀法、微管吮吸法、MTT 法和考马斯亮蓝法分别检测 BMSCs 的黏附和增殖性能的变化;应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测 BMSCs 的 ALP 表达水平并通过 RT-PCR 检测细胞 ALP、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原的表达,通过免疫荧光染色检测核心结合因子 a1(Cbfa1)表达,观察 BMSCs 向成骨细胞方向分化的情况。结果 XPS 图谱证实含 RGD 肽K16GRGDSPC 被成功地接枝到 PLGA-[ASP-PEG]表面。复合 BMSCs 培养结果表明,改性后的 PLGA-[ASP-PEG]表面 BMSCs 的黏附性能和增殖能力明显提高,而且其成骨标志物(ALP、OCN、OPN、Ⅰ型胶原和 Cfbal)的表达均显著高于对照组(P<0.05)。结论含 RGD 肽 K16GRGDSPC 能促进 BMSCs在骨基质材料表面的黏附、增殖并诱导其向成骨方向分化。

骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞优化生物活性玻璃的实验研究

目的研究兔成骨细胞在生物活性玻璃复合材料支架中的生长情况,探讨优化组织工程中生物材料支架的实验方法。方法分离并培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),应用成骨诱导剂诱导MSCs向成骨细胞分化、发育;在显微镜下观察细胞形态学变化;通过细胞活性、免疫组化鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。将成骨细胞分别附着在3种不同生物活性玻璃组成的新型材料支架中,进行共培养,观察细胞的变化,从而比较不同生物活性玻璃与成骨细胞的相容性。结果MSCs经成骨诱导剂诱导后:细胞数量明显增多,细胞形态向多角形及类圆形转化。经诱导的兔成骨细胞与生物活性玻璃组成的材料支架融合后,发现兔成骨细胞在孔隙率为75.90%的支架中增殖较慢;在孔隙率为90.20%和94.50%的生物活性玻璃复合材料支架中生长良好,增殖较快,孔隙及周围有大量成骨细胞附着。结论具有适宜孔隙率的生物活性玻璃复合材料有望成为培养人工骨的种子支架,为骨组织工程的临床应用奠定了实验基础。