大鼠去卵巢后骨髓源性破骨细胞形成的动态变化及其与骨髓IL-6、IL-6受体表达的关系

目的 观察大鼠去卵巢后骨髓源性破骨细胞形成的动态变化及其与骨髓细胞IL-6、IL-6受体以及gpl30基因表达水平改变的关系。方法 健康3月龄雌性SD大鼠60只,30只作为假手术对照组,30只经腹手术去卵巢。分别于去卵巢后2,4,6,8,12周取去卵巢组和对照组各6只大鼠骨髓细胞作细胞培养和提取RNA。培养的第6天分别作瑞氏-吉姆萨染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,以胞核3个或3个以上以及TRAP(+)为破骨细胞标志,计数细胞数。骨髓细胞提取总RNA进行逆转录PCR。结果 术后2周去卵巢组破骨细胞形成数即多于对照组(P<0.05);第4-6周,去卵巢组破骨细胞形成达高峰,明显多于2周(P<0.01);去卵巢后的8周,较峰值下降,直至12周去卵巢组破骨细胞形成数仍高于对照组(P<0.05)。与破骨细胞的变化相对应,术后2周,骨髓细胞IL-6及IL-6RmRNA表达均明显增高(分别为P<0.01,P<0.05);第4周时,IL-6表达水平达到高峰,保持至第6周,IL-6R表达则在第6周达最高;第8周,IL-6、IL-6R基因表达水平较峰值下降,但直至第12周仍高于对照组。去卵巢后全程未见gp130基因表达水平有明显变化。结论 大鼠去卵巢后骨髓干细胞分化形成破骨细胞明显增加,呈时间相关动态过程,第6周达高峰,这一过程与骨髓细胞IL-6、IL-6R基因表达的动态变化一致,提示去卵巢后骨髓细?

巨噬细胞集落刺激因子对破骨细胞生物作用的实验研究

目的 探讨在实验条件下巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)在骨代谢过程中对破骨细胞的生物作用。方法 用不同浓度的M CSF和活化核因子κB的受体配体 (RANKL)与鼠骨髓细胞培养 ,在加入或不加入牛骨片的情况下诱导产生破骨细胞。分别用抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)染色法和骨小坑染色法检测TRAP阳性的破骨细胞量及破骨细胞功能。结果 在一定范围内 ,M CSF在RANKL存在的条件下诱导TRAP阳性破骨细胞成熟 ,并随M CSF剂量的增加TRAP阳性细胞数明显增加 (r =0 .75 0 4,P <0 .0 1) ;且骨小坑数量也与M CSF剂量呈明显正相关 (r=0 .93 65 ,P≤ 0 .0 0 0 1)。缺乏M CSF或RANKL均不能诱导TRAP阳性的破骨细胞产生 (P =0 .0 191)。结论 破骨细胞的增殖、分化及成熟是由M CSF和RANKL共同调节的。M CSF是破骨细胞代谢过程中的关键因子 ,具有促进破骨细胞对骨吸收的作用。M CSF对骨代谢的主要作用之一是上调破骨系统。

应用颅骨-破骨细胞联合培养体系研究先天性成骨不全破骨细胞骨吸收活性

目的先天性成骨不全(OI)的主要临床表现为骨矿化过程不良,骨量丢失,骨骼畸形和骨折。但是其发病机理,尤其在其骨再建过程中成骨细胞(OB)及破骨细胞(OC)的功能改变尚不清楚。本实验以先天性成骨不全小鼠模型,oim/oim为基础,应用破骨细胞-颅骨联合培养体系研究OB和OC两种细胞在骨再建过程中的功能改变和相互作用。方法本实验采用小鼠颅骨(CAL)组织培养模型。本模型采用颅骨组织培养,利用颅骨中成骨细胞可以从颅骨片游离出到培养皿及颅骨表面,从而支持培养皿及颅骨表面前体破骨细胞分化成为成熟破骨细胞,并吸收颅骨产生吸收陷窝。本实验中,共2组颅骨-破骨细胞联合培养体系:(1)对照组(WT)颅骨与对照破骨细胞(WTCAL-WTOC);(2)OI颅骨与OI破骨细胞(OICAL-OIOC)。联合培养颅骨及骨髓组织14日后,以TRAP免疫组化染色方法识别破骨细胞,ALP免疫组化染色方法识别成骨细胞,计算OC/OB。破骨细胞骨吸收活性以颅骨表面骨吸收陷窝占颅骨表面百分比并除以培养系统中的破骨细胞数表达。结果第14日,OICAL-OIOC组的破骨细胞数低于WTCAL-WTOC组(92.50+23.18/mm2对比379.00+136.53/mm2,P<0.01);OICAL-OIOC组的OC/OB明显低于WTCAL-WTOC组(0.68+0.57对比1.65+0.67,P<0.01);OICAL-OIOC组OI破骨细胞的吸收能力高于WTCAL-WTOC组(27.76+22.81对比7.32+5.09,P<0.001)。结论 oim/oim小鼠破骨细胞-颅骨培养体系中破骨细胞的数目明显减少,成骨细胞支持破骨细胞分化能力减低;但其破骨细胞骨吸收活性明显增强,以代偿成骨细胞功能,维持骨再建过程中成骨过程及骨吸收过程的平衡。

晚期氧化蛋白终产物对破骨细胞分化的影响

目的探讨晚期氧化蛋白终产物(AOPPs)对破骨细胞分化的影响。方法体外分离培养大鼠骨髓单核细胞,分为空白对照组、阴性对照组(RSA)、AOPPs组、阳性对照组(RANKL)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂组(AOPPs+夹竹桃麻素),干预6 d后,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞,鬼笔环肽荧光染色观察F肌动蛋白(F-actin)环,甲苯胺蓝染色观察骨磨片的骨吸收陷窝。此外,AOPPs刺激2 h后,通过DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)生成。结果 AOPPs及阳性对照组RANKL均可诱导TRAP阳性多核细胞、F-actin环及骨吸收陷窝形成,并且AOPPs刺激后细胞ROS生成明显增多。AOPPs所致以上效应均能被NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素阻断。结论 AOPPs可诱导大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化。

miR-181a调控骨髓间充质干细胞中OPG水平及对破骨细胞活性的影响

该研究预测并验证骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)中mi R-181a对靶分子骨保护素(osteoprotegerin,OPG)m RNA水平的调控作用,探讨其在骨质疏松发病过程中对破骨细胞活性的影响。通过生物信息学预测mi R-181a可能调控的靶基因OPG,构建含mi R-181a结合位点的OPG m RNA 3′UTR(3′untranslated regions)荧光素酶报告载体。通过双荧光素酶载体系统检测mi R-181a与OPG m RNA 3′UTR相互作用对荧光素酶活性的影响;转染mi R-181a进入BMMSCs并与破骨细胞共培养,TRAP(tartrate resistant acid phosphatase)染色检测共培养体系中破骨细胞数目的改变。结果表明,双荧光素酶报告提示,mi R-181a的靶分子为OPG m RNA,上调mi R-181a(mimics组)水平后,破骨细胞数目较对照组显著增多(P<0.05);下调mi R-181a(inhibitor组)水平后,破骨细胞数目较对照组显著降低(P<0.05)。研究结果显示,mi R-181a可以负调控OPG的蛋白水平,进而影响破骨细胞活性。