Experimental Study of the Anti-human Papilloma Virus Mechanisms by a Traditional Chinese Medicine “Keyouling”

To investigate the anti-human papilloma virus (HPV) effect of the external liniment of traditional Chinese medicine “Keyouling”, the efficacy of this drug acting upon the proliferation and growth of the normal epidermis cells of rabbits′ penis prepuce in different concentrations was observed. An experimental model of pathology of histocytes infected with HPV in vitro was established by using the human HPV infected prepuce epidermis cells as virus carrier to infect the sub-cultured epidermis cells of rabbits′ penis prepuce. The direct killing effect and the blocking effect of infections of epidermis cells in rabbits′ penis prepuce induced by HPV with different concentrations of “Keyouling” were determined by 3 kinds of culture methods: (1) the infected epidermis cells of rabbits′ penis prepuce were challenged by co-culture with HPV suspension and with culture medium containing drug; (2) the co-culture with epidermis cells of rabbits′ penis prepuce and HPV suspension was challenged with drug; (3) co-culture with culture medium containing drug and epidermis cells of rabbits′ penis prepuce was challenged with HPV suspension. It was found that “Keyouling” had little effect on the proliferation and growth of the normal epidermis cells of rabbits′ penis prepuce, but it had direct killing effect on HPV, and blocked effectively the infection of the epidermis cells of rabbits′ penis prepuce by HPV. It concludes that “Keyouling” has significant killing effect to HPV, but not normal histocytes in vitro , indicating that it is safe for clinical use. Its blocking effect on the HPV infection of rabbits′ penis prepuce epidermis cells suggested “Keyouling” may be clinically used to prevent the development of tumors or to inhibit the further progression or metastasis of tumors.

中医药干预白血病干细胞免疫逃逸研究进展

白血病是目前临床上高发的急危重症,病死率极高,其中白血病干细胞(leukemia stem cells,LSC)发生免疫逃逸是白血病诱导缓解后复发及进展的主要因素。中医药(Traditional Chinese Medicine,TCM)临床诊疗具有鲜明的辨证论治优势,基于“以平为期”的诊治目的,中医药辨治白血病强调恢复人体机能的“阴阳和谐”,有助于提高机体自身免疫力,符合干预肿瘤细胞免疫逃逸的机制。本文从文献研究及中医理论探讨中医药干预LSC免疫逃逸的机制及其研究进展。

Notch信号通路与骨质疏松症及中医药防治

背景:近年研究表明,Notch信号通路对骨质疏松症有不同程度的影响,深入该方向的研究对骨质疏松的防治具有重要意义。目前,中医药以其多角度、多层次和不良反应小的明显优势在缓解骨质疏松方面发挥显著作用,已成为当今社会研究的重点。目的:分析、整理国内外文献,进一步了解Notch信号通路与骨质疏松症的联系,阐明中医药调控Notch信号通路防治骨质疏松症的作用机制。方法:以“Notch、骨质疏松症、成骨细胞、破骨细胞、骨髓间充质干细胞、信号通路、中药、丸、实验”等为中文检索词,检索中国知网、万方、维普数据库;以“Notch、osteoporosis、Osteoblasts、Osteoclasts、Mesenchymal stem cells、Signal pathway、traditional Chinese medicine、pill、experiment”等为英文检索词,检索PubMed、Nature、Embase数据库,选择各数据库建库至2022年10月的相关文献。结果与结论:Notch信号通路通过参与调控间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞的分化、增殖,从而在不同程度上影响骨质疏松症的发生和进展;Notch信号通路通过直接或间接调控Notch1、Jagged1、Hes、Hey、巨噬细胞集落刺激因子、核因子κB受体活化因子配体等关键细胞因子调节间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化,进而对骨形成起到促进或抑制的作用,最终对骨质疏松症起到一定的防治效果。中药活性成分大多从补肾类中药提取,如淫羊藿、杜仲、补骨脂、刺五加、女贞子等,且中药复方及制剂都具有补肾强骨的功效,这为后续研究Notch信号通路向防治骨质疏松症提供更多的中药选择和方向。目前中药的研究多为活性成分和单味药提取物,中药复方及制剂的临床实验研究相对较少;关于针灸、推拿、中西医结合等疗法调控Notch信号通路防治骨质疏松症的研究较少,未来还需继续探索中医技术类疗法及中西医结合等疗法对Notch信号通路的调控和对骨质疏松治疗的作用机制。

淫羊藿苷对衰老骨髓间充质干细胞成骨的影响

目的探究淫羊藿苷(icarrin,Ica)对D-半乳糖(D-gal)诱导的衰老骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨的影响及机制。方法通过全骨髓贴壁法提取BMSCs,采用流式细胞术及成骨、成脂诱导分化鉴定细胞。通过CCK8法检测D-gal及Ica处理BMSCs的最适浓度,用D-gal诱导BMSCs衰老,药物干预48 h;6SA-β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况;碱性磷酸酶试剂检上清液ALP水平;RT-PCR和Western Blot分别检测BMSCs中衰老相关P16、P53、P21及成骨相关Foxo3a、β-catenin的蛋白表达。结果BMSCs表面标志物CD44和CD90表达大于95%;CD34、CD45表达小于5%,且能被定向诱导分化出钙结节及脂滴,鉴定细胞为BMSCs。CCK8检测出30 mg/mL为D-gal的最适浓度,10-8、10-10mol/L为Ica最适浓度。Ica能减少衰老BMSCs中P16、P53、P21 mRNA的表达;降低Foxo3a mRNA和蛋白表达,增加β-catenin mRNA和蛋白的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论D-gal能够诱导构建出衰老BMSCs模型;Ica增加了衰老BMSCs上清液中的ALP含量、降低了衰老BMSCs中P53的表达水平,可能通过调节成骨相关信号通路Foxo3a/β-catenin表达,起到对衰老BMSCs成骨分化能力的改善作用。

续断提取物对骨质疏松性大鼠信号通路作用的研究进展

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是骨吸收大于骨形成的骨代谢疾病,随着全球老龄化加重,严重威胁人类健康安全。续断作为传统补肾中药在防治OP方面具有广阔潜力,有关研究表明续断通过多靶点、多途径调控相关信号通路防治OP。最新药理学研究证明续断提取物木通皂苷D等成分可通过调控有关信号通路和促炎因子干预碱性磷酸酶、骨保护蛋白、骨钙素等蛋白因子表达,作用于成骨细胞、破骨细胞以及骨髓间充质干细胞有效防治OP。通过检索续断提取物防治OP的基础研究发现,续断提取物木通皂苷D、熊果酸、多糖类可以通过Wnt/β-catenin、MAPK、PI3K/AKT、BMP-Smads信号通路促骨形成,通过OPG/RANKL/RANK、雌激素信号通路抑制骨吸收防治OP。笔者就续断提取物调控不同信号通路,促进成骨细胞增殖,抑制破骨细胞分化,诱导骨髓间充质干细胞定向分化作一综述,为今后中医药防治OP的基础研究提供新思路。

中医不同治法调控ERK2、JNK促进肌源性干细胞向成骨分化的研究

目的通过观察中医不同治法促进大鼠肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)成骨分化及细胞外调节蛋白激酶2(extracellular regulated protein kinase 2,ERK2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)蛋白表达情况,探究基于“脾肾相关”理论下,中医防治骨质疏松症(osteoporosis,OP)的作用机制。方法在随机数字表法下,将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组及补肾健脾组,制备含药血清,选取第4代大鼠MDSCs进行实验,CCK8法检测细胞增殖,p-NPP法检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,ELISA法检测细胞ERK2、JNK蛋白表达。结果①各组均可促进MDSCs增殖。②与正常组相比,各组ALP活性显著升高(P<0.01),其中补肾健脾组最高。③诱导组、补肾组、补肾健脾组ERK2蛋白表达显著高于正常组(P<0.01),健脾组高于正常组,差异无统计学意义;各组JNK蛋白表达显著低于正常组(P<0.01)。结论①补肾健脾法促进大鼠MDSCs成骨分化的效果最佳,表明在“脾肾相关”理论指导下,加强了肌肉骨骼之间的相互作用,可以对OP起到防治效果。②ERK2、JNK蛋白表达变化,提示中医治疗OP的作用机制可能与调控ERK2、JNK蛋白表达有关,这为中医临床诊疗OP提供了新的方向。

川续断提取物续断皂苷Ⅵ防治骨质疏松症的研究进展

随着我国老年人绝对数量的增长以及老龄化加速,骨质疏松症(osteoporosis,OP)已然成为我国需要面对的公共健康问题。近年来对续断防治OP的基础及临床研究成为热点,研究发现川续断皂苷Ⅵ具有较好的防治OP的功效,可以通过多个细胞层面及生物学通路干预骨代谢,从而发挥治疗OP的作用。笔者从续断皂苷Ⅵ对BMSCs、成骨细胞、破骨细胞及相关生物学信号通路的影响来综述续断皂苷Ⅵ防治骨质疏松的研究概况,以期为续断皂苷Ⅵ的基础研究、临床应用及新药开发等提供参考。

骨康含药血清对细胞共育体系中OPG、RANKL的影响

目的:研究骨康含药血清对细胞共育体系中OPG、RANKL的影响。方法:以成骨-破骨细胞共培养液上清中OPG、RANKL及其比值为指标进行实验观察。结果:加入血清培养后,自第3天起骨康组OPG含量明显高于同时期空白组(P<0.01),而空白组培养过程中无明显变化。骨康组RANKL含量第7天明显下降(P<0.05),而空白组无明显变化(P>0.05)。自第3天起骨康组OPG/RANKL比值显著高于空白组(P<0.05,P<0.01)。在培养第5、7天骨康组OPG/RANKL比值较初始比值明显增大(P<0.05),而空白组在培养过程中无明显变化。结论:骨康含药血清对成骨细胞和破骨细胞均有影响,可改变细胞生存环境中OPG/RANKL的比例,间接影响破骨细胞的功能活性。

龟板调控BMSCs增殖、迁移和成骨分化及其抗骨质疏松症的研究进展

近年来,中医药在抗骨质疏松症方面显示出独特优势。龟板被证实可通过miRNA及其靶基因、信号通路及相关因子调控BMSCs功能,从而抗骨质疏松症。本文对龟板调控BMSCs增殖、迁移和成骨分化及其抗骨质疏松症的研究进展进行综述,发现龟板体外可通过调节BMP-4、VDR、RARα、Id1等表达调控BMSCs增殖;可上调HGF/c-met轴、SDF-1/CXCR4轴促进BMSCs迁移;可通过调节成骨相关因子、miRNAs和信号通路调控BMSCs成骨分化。此外,龟板体内可有效抗PMOP、GIOP和SOP。本文旨在为中医药防治骨质疏松症提供相关参考。

骨碎补经骨髓间充质干细胞调节OPG/RANKL/RANK通路抑制破骨细胞的实验研究

目的研究骨碎补作用绝经后骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)调节OPG/RANKL/RANK通路及对破骨细胞分化成熟的影响并探讨其可能的作用机制。方法实验大鼠去双侧卵巢造模,分为实验组(OVXDF,造模+骨碎补水煎液灌胃)、模型组(OVX,造模+0.9%生理盐水灌胃)、假手术组(SHAM,假手术+0.9%生理盐水灌胃),造模成功后提取BMSCs,将BMSCs和骨髓单核细胞共培养于Transwell小室的上室和下室,分为实验组+破骨细胞(OVXDF+OC)、模型组+破骨细胞(OVX+OC)、假手术组+破骨细胞(SHAM+OC)。下室加入破骨细胞诱导剂,倒置相差显微镜观察破骨细胞的分化成熟情况并计数,酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测下室培养液中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、RANKL的含量,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测BMSCs中Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRAN及蛋白表达并计算RANKL/OPG。结果在共培养系统中,与去卵巢灌胃大鼠BMSCs共培养的破骨细胞(OVXDF+OC)数量较单纯模型组+破骨细胞(OVX+OC)明显减少(P<0.05)。下室培养液OPG含量及共培养BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG mRAN及蛋白表达模型组+破骨细胞(OVX+OC)最低,RANKL及RANKL/OPG最高,经骨碎补灌胃后(OVXDF+OC)培养液中OPG含量及BMSCs细胞中Wnt10b、β-catenin、OPG mRAN及蛋白表达明显升高,培养液及BMSCs细胞中RANKL及RANKL/OPG明显降低(P<0.05)。结论骨碎补可调节BMSCs细胞OPG、RANKL的表达,激活OPG/RANKL/RANK信号通路抑制破骨细胞的分化和成熟,此作用可能与BMSCs的Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

骨碎补总黄酮对MLO-Y4细胞增殖、分化、矿化和凋亡影响的探究

目的研究骨碎补总黄酮对MLO-Y4类骨细胞系增殖、分化、矿化以及凋亡的影响。方法体外培养MLO-Y4细胞,并以MC3T3-E1细胞作对照细胞,分别用不同质量浓度(1,10,100 mg/l)的骨碎补总黄酮干预,采用CCK-8法以及ALP试剂盒检测MLO-Y4细胞的增殖和分化情况;用茜素红染色法观察矿化结节的形成;DAPI染色和流式细胞术定性和定量反映依托泊苷诱导的细胞凋亡情况。结果 1,10 mg/l浓度组的骨碎补总黄酮能促进MLO-Y4细胞的增殖,并且能够一定程度上促进细胞ALP的合成分泌,100 mg/l组不具有促进细胞增殖,ALP合成分泌的作用。三个浓度组均无影响MLO-Y4细胞钙结节形成的作用。1,10 mg/l组对依托泊苷诱导的细胞凋亡具有一定的抑制作用,100 mg/l组则相反。结论一定浓度的骨碎补总黄酮对MLO-Y4细胞的增殖,分化有一定的促进作用,并能够抑制其凋亡。

中药双黄补对人牙周膜细胞总蛋白含量和超微结构的影响

目的:探讨中药双黄补对人牙周膜细胞总蛋白含量和超微结构的影响。方法:采用组织块法体外培养人牙周膜细胞,取第5代培养细胞随机分为实验组和对照组,实验组加不同浓度的双黄补,对照组只加培养液。通过考马斯亮蓝法测定牙周膜细胞总蛋白含量,透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化。结果:不同浓度的中药双黄补对人牙周膜细胞的总蛋白含量均有提高作用,其中尤以100μg/ml效果最佳。电子显微镜下可见胞质内粗面内质网、线粒体等细胞器数量增多。结论:中药双黄补可促进人牙周膜细胞的蛋白质合成,使细胞代谢更旺盛,功能更活跃。

木通皂苷D促进糖皮质激素环境下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

目的观察木通皂苷D(ASD)对糖皮质激素(GC)环境下小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响及其机制。方法体外培养小鼠BMSCs,实验分为三组,分别用成骨诱导培养基(OBI)、OBI+地塞米松(DEXA,0.1μmol/L)、OBI+DEXA(0.1μmol/L)+ASD(10μmol/L)干预。ALP试剂盒检测ALP活性,茜素红染色检测矿化情况,qRT-PCR检测成骨因子Runx2、骨钙素(OCN)及Smad1、Smad5 mRNA表达,Western blot检测Smad1/5磷酸化水平及Smad1/5/8总蛋白表达。结果OBI+DEXA组ALP活性明显较OBI组低(P<0.001),OBI+DEXA+ASD组ALP活性明显较OBI+DEXA升高(P<0.01)。OBI+DEXA干预组成骨相关因子Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表达较OBI组均明显下调(P<0.01),OBI+DEXA+ASD组Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表达较OBI+DEXA干预组明显上调(P<0.01和P<0.05)。三组Smad1/5/8总蛋白表达差异无统计学意义,OBI+DEXA干预组pSmad1/5较OBI干预组表达降低,OBI+DEXA+ASD干预组pSmad1/5表达较OBI+DEXA干预组增加。结论ASD可促进GC环境下小鼠BMSCs成骨分化,其机制可能与激活BMP/Smad信号通路有关。

中药抑制黑素生成作用的筛选研究

目的:通过研究中药对小鼠黑素细胞系Mel-Ab及melan-a黑素生成的影响,筛选出有减少黑素生成作用的中药。方法:药物处理Mel-Ab细胞后分别进行黑素含量和细胞生存率的测定。选取的中药在melan-a与鼠角质形成细胞系SP-1共培养做进一步实验。熊果苷作为阳性对照。结果:川芎、威灵仙、桂枝、麦冬、白果、蒿本、红花、白苏叶的醇提物,五倍子的水提物在细胞培养水平对黑素生成有明显抑制作用,强于相同浓度熊果苷的作用。其中五倍子、威灵仙、白果、川芎在共培养中作用效果更为显著。结论:本研究表明上述九种中药提取物对黑素生成有明显的抑制作用。

5种抗菌中药体外抗衣原体活性研究

采用McCoy细胞培养衣原体的方法筛选有抗衣原体活性的中药。结果表明穿心莲、车前子、栀子、地肤子和牡丹皮浓度为50～200mg/ml时能显著减少包涵体数目(P<0.01)。其最大抑制率分别为93％,87％,85％,80％和70％。说明这5种抗菌中药具有体外抗生殖道衣原体作用。

中药活性成分靶向激活AMPK防治骨质疏松症的研究进展

骨质疏松症作为一种慢性代谢性疾病影响中老年人的正常生活。临床上,防治骨质疏松症缺少靶点明确和药效显著的特效药已成为亟待解决的棘手难题。AMP活化蛋白激酶(AMPK)作为细胞的能量感受器,在骨质疏松的关键病因——骨重建失衡中发挥着重要作用,可以直接影响骨多细胞单位中骨髓间充质干细胞(BMSCs)、成骨细胞和破骨细胞,已有越来越多的研究发现并报道了中药活性成分靶向AMPK抗骨质疏松的作用和机制,取得了一定的研究成果。通过Web of Science、Pubmed、万方和中国知网数据库等对于近10年相关文献进行检索,搜集并整理最新的研究进展,对于BMSCs、成骨细胞和破骨细胞中AMPK的相关作用进行梳理,涉及BMSCs中Wnt/β-catenin、ERK、mTOR和Gfi1/OPN,成骨细胞中Wnt/β-catenin和BMP-2/Smad以及破骨细胞中c-Fos/NFATc1等不同的下游信号通路。以中药活性成分白藜芦醇、人参皂苷Rd、柚皮苷、芒柄花黄素、血根碱和高车前素等相关研究作为依据进行阐述和论证,为更好地发挥和探究中药及其活性成分靶向AMPK抗骨质疏松的作用机制提供新思路。

中药活性成分的生物转化研究进展

化学工业的可持续发展性,推动了生物法生产化学品的研究。利用生物转化法生产中药活性成分是实现中药产业化的重要途径之一。综述了近年来通过植物细胞培养转化合成中药活性成分的研究进展,讨论了目前存在的问题和解决办法。

青光安颗粒剂对自发性青光眼模型小鼠的降眼压作用及房水动力学的影响

背景研究表明青光眼的眼压增高与转化生长因子-β（TGF-β）促进小梁网细胞外基质的堆积以及黏附分子CD44导致房水排出阻力增加有关。传统中药青光安颗粒剂是中医临床上常用的降跟压药物，其是否通过小梁网通路发挥作用尚不清楚。目的研究青光安颗粒剂对自发性青光眼模型DBA／2J小鼠房水动力学的影响及其作用机制。方法选取lO只眼压正常的3月龄雌性DBA／2J小鼠作为对照组，采用计算机随机数字分配法将20只9月龄自发性眼压升高的DBA／2J小鼠随机分为高眼压组和青光安组，青光安组小鼠采用2．5g／kg复方青光安颗粒剂灌胃，每天2次，连续15d，对照组和高眼压组小鼠以相同剂量生理盐水灌胃。采用经前房注入／抽吸系统进行眼压测量，分别以2．5、5．0μl／min的速率继续灌注，计算房水流畅系数（c）值和房水流出阻力（R）值。将3月龄DBA／2J小鼠60只按计算机随机数字分配法分为高剂量青光安组、中剂量青光安组、低剂量青光安组和空白对照组，每组各15只，分别用25．00、12．50和6．25g／kg青光安颗粒剂灌胃，空白对照组用等容量生理盐水灌胃，给药后7d麻醉条件下提取各组小鼠含青光安药物血清和空白对照动物血清，然后收集各组小鼠含小梁网巩膜组织进行培养，采用纤连蛋白（FN）、层黏连蛋白（LN）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色鉴定小梁网细胞。终质量浓度为0、5、10、20、50和100ng／ml的TGF-β处理小梁网细胞24h，采用MTT比色法检测各组细胞活性；用不同质量浓度含药血清培养经20ng／mlTGF-β处理的小梁细胞，分别于培养后24、48和72h采用ELISA法检测细胞上清液中TGF-β2受体质量浓度，采用Westernblot法检测各组小梁网细胞中CD44蛋白的相对表达量。结果对照组、高眼压组和青光安组小鼠在2．5td／min和5．0μl／min灌注速率下眼压明显不同，高眼压组小鼠眼压值明显高于青光安组和对照组，青光安组小鼠c值较高眼压组明显降低（1．08±O．36％2．35±1．34），R值明显增加（1．05±O．47 vs 0．64±0．55），差异均有统计学意义（均P〈O．01）。原代培养的细胞呈长梭形，FN、LN和NSE均呈阳性表达。5、10和20ng／mlTGF．p处理组细胞活力值明显低于0ng／mlTGF-β处理组细胞，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。与空白对照组比较，TGF．母组小梁网细胞上清液中TGF-β2受体质量浓度和细胞中CD44蛋白相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（均P〈O．01）；细胞培养后24、48和72hTGF-β高剂量含药血清组细胞上清液中TGF-β2受体质量浓度和细胞中CD44相对表达量均明显低于TGF-β组和TGF-B＋低剂量含药血清组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论青光安颗粒剂通过影响房水动力学因素达到降低青光眼眼压的作用。青光安含药血清能明显降低体外培养的鼠小梁网细胞中TGF-β2受体和CD44的表达。

中药骨康调控成骨细胞核内结合因子α1的表达

背景:中药骨康在临床上治疗骨质疏松疗效明确,但其具体作用途径尚不清晰。目的:假设中药骨康通过调节核内结合因子 a1 水平,控制其下游基因核因子κB受体活化因子配体和骨保护素表达,起到调控成骨细胞生长发育的作用。方法:新生 24 h 内的 SD 乳鼠用于成骨细胞的分离培养。成年 SD 雌性大鼠用于制备药物血清,随机分为正常血清组和中药骨康组。2 组大鼠按体表面积的方法给予中药骨康方的提取药物和生理盐水灌胃,连续给药 1周。最后一次用药后 2 h 行心脏采血,分离血清。原代培养并传至第 3 代经碱性磷酸酶鉴定取得的大鼠成骨细胞,消化计数铺板并分为 2 组,以上述血清处理 72 h,MTT 法检测成骨细胞的增殖率,ELISA 方法检测碱性磷酸酶分泌量并以相应吸光度值进行纠正,运用 RT-PCR 检测 2 组成骨细胞核内结合因子α1 及其下游核因子κB受体活化因子配体和骨保护素 mRNA 表达情况。结果与结论:中药骨康组成骨细胞骨保护素和核内结合因子 a1 mRNA 水平显著高于正常血清组,核因子κB受体活化因子配体蛋白和 mRNA 水平显著低于正常血清组(P < 0.01)。实验结果证实,中药骨康可通过影响核内结合因子 a1 表达,调控其下游基因核因子κB受体活化因子配体和骨保护蛋白表达和分泌,进而发挥治疗骨质疏松的作用。

六味地黄方含药血清对H_(2)O_(2)诱导的氧化损伤MC3T3-E1细胞Runx2、OPG/RANKL的干预作用及其机制探讨

目的观察六味地黄方含药血清对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的氧化损伤小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)Runt相关转录因子2(Runx2)及护骨素/核因子-κB受体活化因子配体(OPG/RANKL)的干预作用,并从抗氧化角度初步探讨其作用机制。方法制作六味地黄方汤剂,对成年Wistar大鼠进行灌胃,获取六味地黄方含药血清。除正常组外,其余各组先用1.0 mmol/L H_(2)O_(2)预处理MC3T3-E1细胞6 h,随后模型组更换正常培养基,N-乙酰半胱氨酸(NAC)组更换含有2.5 mmol/L NAC的培养基,六味地黄方含药血清组更换含有10%药物血清的培养基,各组均处理24 h。采用DCFH-DA荧光探针检测MC3T3-E1细胞内活性氧(ROS)水平。根据试剂盒说明书检测过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、还原型谷胱甘肽(GSH)。采用Western blot法检测Runx2、OPG、RANKL、肿瘤抑制蛋白P53及磷酸化状态的P53蛋白(p-P53)表达。结果与正常组比较,模型组ROS明显升高(P<0.05),同时CAT、SOD、GSH-PX、GSH均明显降低(P<0.05);在蛋白表达方面,与正常组相比,模型组Runx2、OPG蛋白表达均明显降低(P<0.05),RANKL蛋白表达明显升高(P<0.05),同时p-P53/P53也有明显升高(P<0.05)。与模型组相比,六味地黄方含药血清组GSH明显升高(P<0.05),ROS水平明显下降(P<0.05)。在蛋白表达方面,与模型组比较,六味地黄方含药血清组Runx2、OPG蛋白表达均明显升高(P<0.05),RANKL蛋白表达明显降低(P<0.05),同时p-P53/P53明显降低(P<0.05)。结论六味地黄方含药血清能促进H_(2)O_(2)致氧化损伤MC3T3-E1细胞内Runx2蛋白表达,升高OPG蛋白表达,降低RANKL蛋白表达,这可能与其升高GSH的含量、抑制P53蛋白的磷酸化,进而降低细胞内ROS水平有关。