Aurora-B激酶特异性抑制剂AZD1152-HQPA对人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞的抑制作用

目的探讨激光(Aurora)-B激酶特异性抑制剂AZD1152-HQPA对人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞的抑制作用。方法用不同浓度的AZD1152-HQPA(0、10、50、100、500 nmol.L-1)体外作用于人骨肉瘤细胞株U2-OS24、48、72 h,采用噻唑蓝(MTT)检测AZD1152-HQPA对人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞的抑制作用;采用Western Blotting检测AZD1152-HQPA作用于人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞前后Aurora-B激酶的表达情况。结果 AZD1152-HQPA对人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞生长抑制作用明显,且抑制呈时间-浓度依赖性。50 nmol.L-1AZD1152-HQPA作用24、48、72 h,人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞中Aurora-B激酶的表达随作用时间的延长而降低。结论 AZD1152-HQ-PA能抑制U2-OS细胞生长,并且抑制作用呈时间-浓度依赖性。

氯化锂对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表达的影响

目的:研究氯化锂(LiCl)对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖及凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法:以40、80、150mmol/L的LiCl作用于U2-OS细胞24、48和72h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;作用48h后,流式细胞术法检测细胞凋亡率,并分析细胞周期;RT-PCR法检测凋亡相关基因Fas、Caspase-3mRNA的表达。结果:随LiCl作用剂量的增加,U2-OS细胞增殖抑制率增加,细胞凋亡率和Fas、Caspase-3mRNA表达量亦增加(F=61157.480,70.828和418.072,P<0.001);细胞周期分析显示细胞被阻滞于S期(P<0.001)。结论:LiCl可能通过促进凋亡基因Fas、Caspase-3的表达,抑制U2-OS细胞增殖并诱导凋亡。

浅蓝菌素联合表阿霉素对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖的抑制作用

目的研究浅蓝菌素(Cerulenin)增强表阿霉素(Epirubicin)对人骨肉瘤细胞(U2-OS)抑制作用。方法在体外表阿霉素和浅蓝菌素单独及联合作用于人骨肉瘤细胞U2-OS,MTT法检测其增殖抑制情况,金氏Q值评价联合用药效应。结果表阿霉素及浅蓝菌素均对人骨肉瘤细胞(U2-OS)有抑制作用;联合用药细胞抑制率明显增高,Q值分别为1.24(1μg/ml表阿霉素+1μg/ml浅蓝菌素)和0.96(10μg/ml表阿霉素+20μg/ml浅蓝菌素)。结论浅蓝菌素能增强表阿霉素对人骨肉瘤细胞(U2-OS)的抑制效应。

转染三磷酸腺苷酶家族蛋白2 shRNA的人骨肉瘤细胞株U2-OS增殖、凋亡能力观察

目的观察转染三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)shRNA的骨肉瘤细胞株U2-OS增殖、凋亡的变化。方法以qRT-PCR法和Western blotting法分别检测人骨肉瘤细胞(U2-OS、MG-63、SaOS-2)和人正常成骨细胞(h FOB1.19)中ATAD2 mRNA、蛋白。在U2-OS细胞中转染ATAD2 shRNA慢病毒载体,采用qRT-PCR法和Western blotting法检测转染效果,CCK8方法检测细胞增殖变化,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成数目,碘化丙啶(PI)单染法检测细胞周期,膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/PI双染法检测细胞凋亡率,Western blotting法检测细胞剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(C-Caspase-3)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK2)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(C-Caspase-9)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白。结果骨肉瘤细胞中ATAD2 mRNA、蛋白表达水平高于正常成骨细胞(P均<0.05)。ATAD2 shRNA慢病毒载体转染后的骨肉瘤细胞中ATAD2表达水平下降(P<0.05)。转染ATAD2 shRNA后的骨肉瘤细胞增殖能力和克隆形成能力均降低,细胞G1期比例升高,细胞凋亡率升高,细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达升高,CDK2、CyclinD1蛋白表达降低(P均<0.05)。结论转染ATAD2 shRNA可抑制U2-OS细胞增殖,并诱导细胞凋亡。

蛋白激酶B抑制剂CCT128930对人骨肉瘤U2-OS细胞凋亡与自噬的影响

目的:研究蛋白激酶B抑制剂CCT128930对人骨肉瘤U2-OS细胞凋亡与自噬的影响。方法:体外培养U2-OS细胞,经0(空白对照,下同)、10、20μmol/L CCT128930作用24 h后采用DNA片段末端标记法观察U2-OS细胞的凋亡情况;经0、5、10、20μmol/L CCT128930作用24 h后采用Western blot法检测细胞中半胱氨酸氨基转移酶3(Caspase-3)、Caspase-8、Caspase-9、Caspase切割底物PARP蛋白表达及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例;将质粒绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(GFP-LC3)转染U2-OS细胞,经0、5、10μmol/L CCT128930作用24 h后采用荧光观察GFP-LC3融合蛋白在细胞内的表达;采用MTT法和Western blot法检测20μmol/L氯喹、CCT128930及二者联合作用于细胞24 h后的细胞活力及Caspase-3、PARP蛋白的表达。结果:与空白对照比较,CCT128930作用后U2-OS细胞凋亡率升高(P<0.01),Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、PARP蛋白表达增强,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例升高(P<0.05或P<0.01),GFP-LC3融合蛋白表达增强;与氯喹联用后,使U2-OS细胞活力和Caspase-3、PARP蛋白表达均下降。结论:CCT128930可诱导U2-OS细胞发生凋亡和自噬,抑制自噬可能促进CCT128930对U2-OS细胞的毒性作用。

miR-194慢病毒表达质粒的构建及对人骨肉瘤细胞系U2-OS转移的相关研究

目的:通过构建携带针对miR-194的慢病毒沉默及过表达载体,研究miR-194对骨肉瘤细胞转移的影响。方法:以miR-194前体及成熟体序列为模板,设计引物,进行PCR扩增,酶切后克隆于慢病毒载体plent-i GFP中,转染293T细胞,包装慢病毒颗粒,检测滴度,最终对人骨肉瘤细胞系U2-OS进行感染。获取稳定感染细胞后,进行Transwell、划痕等实验。结果:1)慢病毒表达质粒构建成功,沉默表达及过表达重组慢病毒的滴度分别为4×108TU/mL及1.5×108TU/mL;2)稳定过表达miR-194的人骨肉瘤细胞系U2-OS的转移能力较其他组有明显降低(P<0.01)。结论:成功构建了miR-194慢病毒表达载体,miR-194的表达水平对U2-OS细胞的转移能力具有显著影响,miR-194可能成为骨肉瘤治疗的潜在新靶点。

bFGF对骨肉瘤细胞系U2-os细胞的促凋亡作用

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨肉瘤细胞系U2-os细胞增殖及生存的影响,探讨bFGF在肿瘤细胞发生发展中的作用。方法:以bFGF处理U2-os细胞,采用台盼蓝排除检测法及MTT法检测细胞存活及增殖情况;用Annexin V-EGFP/PI双染流式细胞术及DNA梯状带检测细胞凋亡情况。结果:bFGF呈浓度、时间依赖性降低U2-os细胞活力并诱导细胞凋亡。结论:bFGF可以诱导U2-os细胞发生凋亡,生长因子在细胞的生长调控方面具有双重作用。

HTLV-1病毒蛋白Tax对U-2 OS骨肉瘤细胞有丝分裂的影响

目的研究人1型T淋巴细胞白血病病毒(HTLV-1)所编码的病毒蛋白Tax对骨肉瘤细胞生长周期的影响。方法通过构建慢病毒表达载体在人骨肉瘤细胞株U-2 OS中表达Tax;荧光显微镜检测表达Tax所引起的骨肉瘤细胞形态和细胞分裂的变化;流式细胞方法分析表达Tax对骨肉瘤细胞周期产生的影响。结果与亲本骨肉瘤细胞比较,表达Tax的骨肉瘤细胞形态由正常的椭圆形转化为长梭形;出现了胞质分裂异常;有双核或多核细胞形成;细胞的生长周期在G2/M期发生了停滞。结论 Tax的表达破坏了骨肉瘤细胞有丝分裂的胞质分裂过程,造成异倍体现象的出现,使细胞停滞在有丝分裂的晚期。这或许是HTLV-1感染导致正常细胞转化为癌细胞的原因之一。

枸橘苷对人骨肉瘤U-2 OS细胞的抑制作用

目的探讨枸橘苷对人骨肉瘤U-2 OS细胞的抑制作用。方法分别以0,5,10,20,40,80,160μmol/L的枸橘苷处理U-2 OS细胞,检测细胞活力并计算枸橘苷对U-2 OS细胞的半数抑制浓度(IC_(50));U-2 OS细胞实验分为空白对照组[等体积磷酸盐缓冲液(PBS)]和枸橘苷高、低剂量组(52,26μmol/L),慢病毒转染细胞实验分为枸橘苷组(A组,52μmol/L)、空白对照组(B组,等体积PBS)、枸橘苷对照组(C组,52μmol/L+50 MOI pLVX-EGFP-C1)、枸橘苷+FBXO2组(D组,52μmol/L+50 MOI pLVX-EGFP-C1-FBXO2)。采用CCK-8法检测细胞活力,集落形成实验检测细胞增殖情况,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞FBXO2 mRNA表达水平,Western blot法检测细胞FBXO2,LC3Ⅰ,LC3Ⅱ,Beclin1,p62,p-STAT3,STAT3蛋白表达水平。结果枸橘苷对U-2 OS细胞的IC_(50)为52.08μmol/L。与空白对照组比较,枸橘苷高、低剂量组细胞在24,48,72 h时的细胞活力显著减弱(P<0.05),克隆形成数显著减少(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),p62蛋白表达水平、FBXO2 mRNA和蛋白表达水平、p-STAT3/STAT3均显著降低(P<0.05);与C组比较,D组细胞在24,48,72 h时的活力显著增强(P<0.05),克隆形成数显著增加(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),p62蛋白表达水平、FBXO2 mRNA和蛋白表达水平、p-STAT3/STAT3均显著升高(P<0.05)。结论枸橘苷可抑制U-2 OS细胞的增殖,并促进其自噬,其机制可能与抑制FBXO2的表达从而抑制STAT3通路激活有关。

CDK抑制剂NSC649890联合顺铂对人骨肉瘤细胞U2-OS的抑制作用

[目的]探讨CDK抑制剂NSC 649890联合顺铂对人骨肉瘤U2-OS细胞抑制作用及可能的机制。[方法]MTT法检测分别采用50、100、200、400、800 nmol/L的NSC 649890 2、4、6、8、10μg/ml顺铂、50 nmol的NSC649890联合2μg/ml顺铂、300nmol的NSC 649890联合6μg/ml顺铂培养48 h后细胞增殖情况,金氏q值评价联合用药效应;流式细胞仪、Western blotting检测分别采用300 nmol/L的NSC 649890、6μg/ml顺铂及二者联合培养48 h后细胞凋亡及凋亡通路相关蛋白表达情况,以上实验均以单纯U2-OS细胞作为对照组。[结果]U2-OS细胞经不同浓度顺铂、NSC 649890单独处理48 h后,细胞抑制率随两种药物浓度增加而显著升高,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。在联合用药组中,顺铂与NSC 649890联合浓度(2μg/ml+50 nmol/L)组两药为协同作用,(6μg/ml+300nmol/L)组两药为相加作用。流式细胞仪检测显示,顺铂组、NSC 649890组及联合组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与对照组相比,顺铂和NSC 649890单独作用后均可下调Bcl-2蛋白、procaspase-3蛋白的表达水平及上调Bax蛋白的表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05),而两者联合作用时效果更加显著(P<0.05)。[结论]NSC 649890能增强顺铂对人骨肉瘤U2-OS细胞的抑制作用。

熊果酸对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖及凋亡的影响研究

目的探讨熊果酸对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖以及凋亡的影响,分析其作用机制。方法取人骨肉瘤细胞株U2-OS分为4组,分别采用浓度为0、10、20、40μmol/L的熊果酸进行培养。培养0、24、48、72 h,应用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖能力变化;培养48 h,使用流式细胞术测定熊果酸对骨肉瘤细胞周期和凋亡的影响,应用实时荧光定量PCR和Western blot检测周期蛋白cyclin D1的表达和凋亡相关蛋白Caspase-3的表达和活化情况。结果 CCK-8检测示,培养0、24 h时各组吸光度(A)值比较,差异无统计学意义(P>0.05);48、72 h时随浓度增加A值逐渐减小,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测示,随熊果酸浓度增加,U2-OS细胞的G_1期增加、S期及G_2/M期减少,细胞凋亡率逐渐增加,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与0μmol/L组相比,10、20、40μmol/L组cyclin D1 m RNA及蛋白相对表达量下调(P<0.05);各组间Caspase-3 m RNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);但随熊果酸浓度增加,Caspase-3前体蛋白下降,活化的Caspase-3增加,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论熊果酸能有效抑制U2-OS细胞增殖,诱导cyclin D1表达下调导致细胞在G_0/G_1期阻滞,同时使Caspase-3活化增加进而促进细胞凋亡。

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖及迁移能力的影响

目的探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖及迁移能力的影响。方法将人骨肉瘤细胞U2-OS分为阴性对照组(Control组)和实验组(CK药物组),MTT方法与CCK-8方法检测细胞活性及增殖能力,细胞划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测侵袭相关蛋白MMP-9及MMP-2的表达。结果CK能够显著降低U2-OS细胞体外活性及生存率(P<0.05);细胞划痕实验及Transwell法证明CK可抑制U2-OS体外迁移能力(P<0.05);CK处理后U2-OS细胞的MMP-9及MMP-2表达水平下调(P<0.05)。结论人参皂苷CK对骨肿瘤细胞U2-OS的抑制作用与下调MMP-9及MMP-2表达水平相关。

RNA干扰神经膜蛋白2基因表达对骨肉瘤细胞生物学特性的影响

目的探究神经膜蛋白2(NRSN2)对骨肉瘤U2-OS细胞增殖、侵袭、迁移的影响以及作用机制。方法实验分为对照组、siRNA阴性组、siRNA-NRSN2组。对照组为常规培养的细胞,siRNA阴性组和siRNA-NRSN2组通过siRNA技术干扰骨肉瘤细胞中NRSN2基因的表达,分别将siRNA-NC和siRNA-NRSN2转染入U2-OS细胞。CCK-8实验检测干扰NRSN2基因表达对细胞增殖的影响。Transwell小室法检测干扰NRSN2对骨肉瘤U2-OS细胞侵袭、迁移的影响。采用免疫印迹试验(Western Blot)检测NRSN2、钙黏蛋白E(E-cadherin)、钙黏蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)水平。结果与对照组相比,siRNA-NRSN2组U2-OS细胞中NRSN2蛋白的表达量显著降低(P<0.05)。干扰NRSN2表达显著抑制U2-OS细胞增殖(P<0.05),降低其侵袭、迁移能力(P<0.05),显著增加Ecadherin蛋白水平,明显降低N-cadherin、Vimentin蛋白水平(P<0.05)。结论干扰NRSN2通过抑制上皮-间质转化(EMT)的发生,阻碍骨肉瘤U2-OS细胞的增殖、侵袭、迁移。

紫草素通过内质网应激蛋白抑制人骨肉瘤U-2 OS细胞增殖的研究

目的研究紫草素对人骨肉瘤U-2 OS细胞存活的抑制和对内质网应激蛋白的调控机制。方法采用CCK-8法检测0.156 25~4μmol/L紫草素对人骨肉瘤U-2 OS细胞抑制率;取对数生长期U-2 OS细胞,分别给予0~4μmol/L紫草素诱导U-2 OS细胞凋亡,24 h后用流式细胞术检测细胞凋亡率;通过Western blotting检测紫草素对内质网应激蛋白ATF6、IRE1α、ATF4、GRP78的表达调控作用;将混有质粒或小干扰RNA的Lipofectamine 2000试剂处理U-2 OS细胞6 h换液,加入紫草素处理,检测ATF4或GRP78对紫草素处理的细胞活力的影响;将ATF4或空白质粒(3μg)、GRP78报告质粒(3μg)和海肾内参质粒(4μg)均匀混合,用Lipofectamine 2000试剂对人骨肉瘤U-2 OS细胞进行转染,6 h换液,加入0.8μmol/L紫草素继续孵育24h,实验结果用各孔海肾荧光做参比进行校正,检测紫草素对ATF4介导的GRP78转录的调控作用。结果紫草素显著抑制人骨肉瘤细胞的活力并能浓度相关性促进细胞凋亡;Westernblotting结果显示,紫草素能特异性增加ATF4和GRP78蛋白的表达;过表达ATF4能显著抑制U-2 OS细胞活力(P<0.01);敲低ATF4能部分逆转紫草素对细胞活力的抑制(P<0.01);过表达GRP78并不影响紫草素对细胞存活的抑制效果,但敲低GRP78可以显著增加紫草素对U-2 OS细胞活力的抑制(P<0.01);报告基因结果显示紫草素能增加ATF4对GRP78基因的转录调控。结论紫草素能显著抑制人骨肉瘤U-2 OS细胞活力,诱导内质网应激蛋白的表达,敲低GRP78能进一步增加紫草素的细胞毒性。

真核细胞表达人骨形态发生蛋白-7的研究进展

针对目前生物系统表达的人骨形态发生蛋白-7(h BMP-7)产量不能满足市场需求量、活性低、成本高的现状,对目前h BMP-7在酵母表达系统、昆虫、哺乳动物组织细胞的表达状况进行综述,分析其各自的优势和局限性,并对h BMP-7真核系统表达进行展望,指出h BMP-7是一种有重要价值的生长因子,具有强烈的骨诱导活性,临床上可用于治疗骨折、骨不愈合,未来的研究重点应是h BMP-7表达量的问题。