OtsAB途径对谷氨酸棒杆菌ATCC 13032胞内海藻糖含量及细胞耐受性的影响

OtsAB途径是谷氨酸棒杆菌胞内海藻糖3条合成途径中最主要的一条．从野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032出发，通过重叠延伸PCR及同源重组技术构建了OtsAB途径缺陷突变株Corynebacterium glutamicum（AotsAB）；利用谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC—XK99E构建重组工程菌株Corynebacterium glutamicum（pECotsAB）过量表达同源otsA及otsB基因．考察了野生型、缺陷型及过量表达菌株对于不同渗透压和培养温度的耐受性及该条件下各菌株胞内海藻糖的含量．结果表明：不同培养条件下，Corynebacterium glutamicum（AotsAB）胞内海藻糖含量与同条件野生型相比减少了34．40％～44．96％，对于渗透压和温度的耐受性明显降低；在相同的培养温度（30℃）、不同的渗透压条件下，Corynebacterium glutami．cum（pECotsAB）胞内海藻糖含量与野生型相比增加了14．53％～34．5％；细胞对于温度和渗透压的耐受性随胞内海藻糖含量的增加而提高．

OsUgp2和otsAB基因共转化增强水稻抗旱抗寒能力

本研究通过农杆菌介导的转化技术,将水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(OsUgp2)与大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶/海藻糖-6-磷酸合成酶磷脂酶融合基因(otsAB)共表达载体转化水稻愈伤组织,对获得的转基因植株分别进行干旱和寒冷处理,试图明确OsUgp2和otsAB共表达是否可以进一步提高转基因水稻植株的抗胁迫能力。表型观察结果显示OsUgp2和otsAB共表达植株(ABU)经干旱和寒冷处理后恢复生长的能力,较otsAB和OsUgp2分别过量表达的转化植株(AB和U)均有所提高。定量PCR检测结果显示:经干旱处理后,转化植株ABU中otsAB和OsUgp2的表达量较未处理植株分别提高1.92倍和1.67倍,与转化植株AB和U中otsAB和OsUgp2表达的增加量相近;而寒冷处理后,转化植株ABU中otsAB和Os-Ugp2的表达量分别增加2.68倍和2.04倍,明显高于转化植株AB和U中otsAB和OsUgp2表达的增加量。液相色谱检测结果显示:OsUgp2和otsAB共表达和单表达均可以提高转化植株中海藻糖的生物合成量,且共转化植株ABU中海藻糖的含量在干旱和寒冷处理前后均是最高的。干旱和寒冷处理后,共转化植株ABU中蔗糖含量的增加也较明显。本研究结果表明OsUgp2和otsAB共表达可以增加转基因水稻植株中海藻糖和蔗糖分子的含量,同时转基因水稻植株的抗旱和耐冷胁迫的能力也得到了一定提高。

以纤维二糖为底物利用重组大肠杆菌合成海藻糖

探讨以纤维二糖为底物合成海藻糖的可行性。首先克隆来自施氏假单胞菌A1501的otsA/otsB基因,外源导入Escherichia coli BL21(DE3)构建以葡萄糖为底物合成海藻糖的OtsAB途径。继而通过过表达E. coli本身的galU基因增加海藻糖合成前体物质尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖的含量,使海藻糖产量提高了3倍。通过添加井冈霉素抑制海藻糖的降解,进一步提高海藻糖的产量。在此基础上,过表达来自天然纤维素分解细菌Saccharophagusdegradans的纤维二糖磷酸化酶基因cepA,使重组大肠杆菌具有利用纤维二糖产海藻糖的能力。利用该重组大肠杆菌全细胞催化生产海藻糖,底物为20 g/L纤维二糖,并添加0.05 mmol/L的井冈霉素抑制海藻糖降解时,48 h后可生成1.3 g/L的海藻糖。本研究利用重组大肠杆菌以纤维二糖为底物合成海藻糖,证实了以纤维二糖为底物合成海藻糖的可行性,为纤维二糖来源精细化学品的生产提供了新的思路。