利用旁侧引物提高重叠延伸PCR定点突变效率

平行模板法简化重叠延伸PCR定点突变流程的思路不能成立,靠近DNA末端的低效限制性酶切才是制约其突变效率的核心原因。故以旁侧引物法提高DNA产物的酶切效率,增加定点突变的成功率。将上、下游引物匹配位点由两侧酶切位点外延50-100 bp,使目标基因两端的酶切位点处于第二轮PCR产物的两端近侧,而非末端。由此提高随后的酶切效率,节省反应时间。由于此时酶切会明显缩短DNA长度,凝胶电泳结果显示仅1 h就完成了对PCR产物的充分酶切。连接产物转化感受态大肠杆菌后形成的克隆数也明显增加,且阳性率由33%-70%提高至100%。经对比检测,旁侧引物法既节省了工作时间,也极大地提高了重叠延伸PCR定点突变过程中的菌落形成数与突变成功率。