oxLDL/β_2GPⅠ复合物与自身免疫背景下AS的关系

在动脉粥样硬化发展过程中,动脉内膜上形成的oxLDL/β2GPⅠ复合物可以释放到循环血液中。在SLE、APS等自身免疫疾病中,可以检测到抗oxLDL/β2GPⅠ复合物的自身抗体,与动脉血栓的形成有高度相关性。本文就自身免疫疾病背景下,对oxLDL/β2GPⅠ复合物的存在、生物学功能及其与动脉粥样硬化关系的研究进展进行综述。

oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物调节A7r5表型转化及脂质转运分子表达

目的探讨氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体复合物(oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab complex)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A7r5)表型转化和细胞表面脂质转运分子的影响,以及toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)信号通路在其中的作用。方法分别用oxLDL、oxLDL/β2GPⅠ复合物、oxLDL/抗β2GPⅠ抗体复合物、β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物、oxLDL/β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物刺激A7r5,收集总RNA和蛋白质,利用实时定量PCR、western blot及免疫荧光染色等方法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、巨噬细胞表面标志CD68、半乳糖凝集素3(galectin-3,LGALS3)、B类清道夫受体3(CD36)和ATP结合盒转运体(ATP-binding cassette transporter)A1/G1(ABCA1/ABCG1)的表达情况;用TLR4阻断剂TAK-242(5μmol/L)或c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinases 1/2,JNK 1/2)阻断剂SP600125(90 nmol/L)预处理的方式,观察TLR4及下游信号分子在oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物诱导A7r5表型转化和脂质转运分子表达变化的作用。结果 oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物明显上调细胞CD68和LGALS3水平,降低α-SMA表达,而TAK-242能够反转该现象;oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物能够促进细胞表达CD36,同时抑制ABCA1/ABCG1表达,TAK-242和SP600125能够逆转该过程。结论 oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物促进A7r5细胞向"巨噬样"细胞发生表型转变,调节脂质转运相关分子的表达,增强脂质向细胞内转运的能力;TLR4和JNK1/2与该过程密切相关。

Toll样受体4在抗β_2GPⅠ-β_2GPⅠ复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症因子中的作用

目的观察抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的效果,探讨Toll样受体4(TLR4)在其中的作用。方法对C3H/He N(TLR4正常)小鼠、C3H/He J(TLR4缺陷)小鼠腹腔注射非特异性兔Ig G(R-Ig G)、抗β2GPⅠ抗体,72 h后用细胞免疫荧光法检测小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物对小鼠腹腔巨噬细胞进行体外刺激,荧光定量PCR法检测细胞表达上述因子的mRNA水平,western blot法检测其蛋白质分泌水平。结果抗β2GPⅠ抗体刺激的C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显高于C3H/He J小鼠,并经细胞免疫荧光法验证;经体外刺激后,荧光定量PCR法结果显示抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物诱导C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平高于空白组或C3H/He J刺激组(P均<0.01);western blot结果显示C3H/He N来源细胞TNF-α、IL-1β、IL-6分泌均显著高于C3H/He J来源细胞(P均<0.01)。结论抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物能够促进小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,TLR4为介导此过程的受体之一。

β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物抑制oxLDL介导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和FAK活化

目的探讨β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体复合物(β2/aβ2)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)介导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和黏着斑激酶(FAK)活化的影响,以及Toll样受体4(TLR4)在该过程中的作用。方法用PMA(100 ng/mL)将THP-1细胞诱导为THP-1巨噬细胞。用RPMI 1640培养液、oxLDL、oxLDL+β2/aβ2和oxLDL+脂多糖(LPS)处理THP-1巨噬细胞,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测脂质转运相关分子ACAT1、ABCA1和ABCG1的mRNA水平;利用Trinder法检测THP-1巨噬细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)含量,并计算胆固醇酯(CE)含量和其占TC的比例;利用免疫荧光和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FAK的蛋白质和mRNA表达并采用western blot检测其磷酸化;最后,利用TLR4阻断剂TAK-242(1μg/mL)预处理的方式,观察TLR4对上述过程的影响。结果β2/aβ2复合物能够抑制oxLDL引起的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和FAK表达与磷酸化,阻断TLR4可以部分逆转这一现象。结论β2/aβ2可以抑制oxLDL引起的巨噬细胞的脂质蓄积和FAK活化,该过程与TLR4有关。

活性氧在Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导中性粒细胞外诱捕网产生中的作用机制研究

目的探讨活性氧(reactive oxygen species,ROS)在抗β2糖蛋白Ⅰ(β2 GlycoproteinⅠ,β2GPⅠ)抗体/β2GPⅠ通过相关信号转导通路诱导中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)形成中的重要作用.方法提取健康志愿者中性粒细胞,PBS刺激作为PBS组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ(10/100μg/mL)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶抑制剂(DPI 20μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activatedprotein kinase,MAPK)抑制剂(SB20358010μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)抑制剂(U012610μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)(50 nmol/L)刺激作为PMA组.流式细胞仪检测中性粒细胞ROS的释放;Western blot检测中性粒细胞p38MAPK、ERK活化.结果与anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组相比,anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组、anti-β2 GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组活性氧释放百分率减少,且anti-β2 GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组抑制作用更明显[anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组:(35.21%±1.22%)比(1.62%±0.08%),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组:(35.21%±1.22%)比(10.21%±0.98%),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组:(35.21%±1.22%)比(8.36%±0.62%),P<0.05)].Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组分别使p38 MAPK、ERK磷酸化水平下降(anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:[(0.601±0.031)比(1.212±0.132),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(0.107±0.001)比(1.612±0.096),P<0.05)],而anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组p38 MAPK、ERK磷酸化水平均无明显下降[anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(1.198±0.068)比(1.212±0.132),P>0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(1.682±0.091)比(1.612±0.096),P>0.05].结论健康志愿者中性粒细胞受anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激形成NETs的过程依赖于相关通路(p38MAPK、ERK)的活化及ROS的释放.p38MAPK、ERK为激发ROS释放的上游信号通路.