对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法测定饲用α-半乳糖苷酶(黑曲霉)活力的方法

旨在建立一种适合于测定饲用α-半乳糖苷酶活力的检测方法。实验利用对硝基酚 -α- D-吡喃半乳糖(p- NPG)作为酶反应底物 ,通过 4 0 0 nm比色检测酶反应所释放的对硝基酚的量来测定饲用酶制剂中 α-半乳糖苷酶的活性。研究表明 ,反应液中所含的对硝基酚的量大于 15 μmol.m L-1时 ,吸光值超过仪器的检测范围 ;酶制剂稀释倍数对对硝基酚比色法的影响较小 ,本底占总酶活的 10 %～ 16 % ,当酶稀释 10 0倍时 ,本底对酶活的影响最小 ;在测定酶活反应时间为 6 min时 ,已经有约 10 %的对硝基酚 - α- D-吡喃半乳糖水解 ,当酶液的酶活在 2 .0 U.m L-1以内 ,测试结果较为准确。考虑到饲用酶制剂的作用环境 ,建议反应温度为 37℃、反应体系 p H 5 .0。

酶底物对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷的合成

以葡萄糖为原料 ,经乙酰化、缩合、分离、脱乙酰化 4步反应 ,合成了临床检验需要的α 葡糖苷酶底物———对硝基苯-α -D-吡喃葡糖苷。所合成的底物通过红外、紫外、核磁、旋光和元素分析确认了结构。

d-生物素的不对称全合成研究(Ⅱ)

1,3-二苄基咪唑啉 -2 -酮 -顺 -4 ,5 -二羧酸经脱水、单酯化 ,拆分成 ( 4S,5 R) -顺 -1 ,3-二苄基 -5 -甲氧基羰基 -2 -氧代咪唑啉 -4 -羧酸 ,再经还原环合 ,硫代成 ( 3a S,6a R) -1 ,3-二苄基 -四氢 -4 H-噻吩并 [3,4 -d]咪唑 -2 ,4( 1 H) -二酮 ( 7) ,后者经格氏反应、脱水、还原、裂解环合一锅合成 ( 3a R,8a S,8b S) -1 ,3-二苄基 -2 -氧代 -十氢咪唑 [3,4 -d]噻吩并 [1 ,2 -a]锍溴化物 ( 1 1 ) ,继而经缩合、开环、水解、脱羧、脱苄而得 d-生物素 ( 1 ) ,总收率为 1 4 .5 % .

d生物素的不对称全合成研究

目的：探索工业生产可行的ｄ生物素的全合成方法。方法和结果：以（１Ｓ，２ Ｓ）（ ＋ ）苏式１（ 对硝基苯基）２氨基１，３丙二醇与顺１ ，３二苄基四氢４Ｈ呋喃并［３，４ｄ］ 咪唑２，４，６三酮（２） 缩合而成的顺１，３二苄基５［（１Ｓ，２Ｓ）（＋ ）苏式１羟甲基２（ 对硝基苯基）２羟乙基］四氢４Ｈ吡咯并［３ ，４ｄ］ 咪唑２，４，６三酮（３） 经高立体选择性还原、水解内酯化成（３ａＳ，６ａＲ）１ ，３二苄基四氢４Ｈ呋喃并［３ ，４ｄ］ 咪唑２，４（１Ｈ）三酮（６），再经硫代、格氏反应、还原制成（３ａＳ，６ａＲ）１ ，３二苄基４羟基４（３乙氧基丙基）四氢４Ｈ噻吩［３，４ｄ］ 咪唑２（３Ｈ）酮（９） ，后者经脱水、还原、裂解环合、脱苄４ 步反应合成（３ａ Ｒ，８ａＳ，８ｂＳ）２氧代十氢咪唑并［４，５ｃ］ 噻吩并［１ ，２ａ］ 锍鎓溴化物（１２） ，继而缩合开环、水解即得ｄ生物素，以２ 计算，总收率２５－７ ％ 。结论：此法原料易得、操作简便、成本较低，适合工业化生产。

高效液相色谱法测定对硝基苯-β-D-葡糖苷的含量

目的:建立高效液相色谱法测定对硝基苯-β-D-葡糖苷的含量。方法:采用 Hypersil C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);紫外检测波长为303 nm;流础利为甲醇-水(30:70),流速为1 mL·min^(-1),柱温为室温。结果:对硝基苯-β-D-葡糖苷苷浓度在3.19～31.9 μg·mL^(-1)的范围内与峰面积具有良好的线性关系(r=0.9999);平均回收率为100.3%(n=9)。结论:本法简便、快速、准确,可用于对硝基苯-B-D-葡糖苷的含量测定。

对硝基苯基α-D-葡萄糖苷的合成及应用

目的合成α-D-葡萄糖苷酶检测底物对硝基苯基α-D-葡萄糖苷,建立临床检测方法。 方法采用Westphal-Feier合成法制备对硝基苯基α-D-葡萄糖苷;依据α-葡萄糖苷酶作用于底物的动力学性质,建立α-葡萄糖苷酶的检验方法。 结果获得高纯度底物对硝基苯基α-D-葡萄糖苷,纯度>99.0％,并开发成试剂盒,批内变异<2.5％,批间变异<3.8％,阳检率85.7％。 结论试剂盒符合临床应用要求。

桔梗中β-D-葡萄糖苷酶的提取研究

以β-葡萄糖转苷酶水解对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)释放的对硝基苯酚(PNP)的量测定β-葡萄糖转苷酶活力为标准。采用稀盐溶液提取桔梗中β-葡萄糖苷酶,通过单因素控制变量法探究桔梗中β-葡萄糖苷酶的存在和活力,确定了最适提取温度为35℃,时间为2 h,料液比为1:25,盐浓度为0.20 mol/L。

对硝基苯基-α-D-吡喃木糖苷的合成

以D-木糖为原料,经全乙酰化、Helferich糖苷化、脱保护基3步反应,合成标题化合物。对Helferich糖苷化条件的催化剂进行了研究,结果表明:在SnCl4的催化下,α-立体选择性最好,产率最高。

对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷钠盐的合成

以葡萄糖醛酸内酯和对硝基酚为原料，经过五步反应合成了对硝基苯基－β－Ｄ－葡萄糖醛酸苷钠盐（ＰＮＰ－ＧＵＡ），熔点２２０℃，并用红外和核磁共振予以确认。以ＰＮＰ－ＧＵＡ为底物，在检测环境样品的大肠杆菌中，得到满意的结果。

对硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷的合成

以D-甘露糖为原料,通过乙酰化、Helferich糖苷化、脱保护3步反应,简便地合成了对硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷。通过正交实验探讨了反应物摩尔比、温度、预先减压时间、反应时间以及催化剂的量对Helferich糖苷化立体选择性和产率的影响。得到最佳反应条件为:1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-甘露糖2.56 mmol,1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-D-甘露糖与对硝基苯酚摩尔比1∶4,催化剂Sn Cl4用量0.308 mmol,预先负压时间和反应时间均为80 min,反应温度为120℃,在该条件下,Helferich糖苷化反应的α-立体选择性最好,产率可达72.4%。

两种测定程序对饲用α-半乳糖苷酶活性检测结果的比较

根据α 半乳糖苷键物质及其结构组成,设计了两种饲用α 半乳糖苷酶活性的检测程序。结果表明,以棉子糖为底物的DNS法,因饲料中干扰因素较多,导致酶活性偏低。而以对硝基苯酚 α D 半乳糖吡喃糖苷底物的p NPG法,具有操作简便,灵敏度高,重现性好等特点。其测定条件为:反应系统pH4.0,反应温度40℃,反应时间10min,底物浓度5mmol/L。

热稳定酸性β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

耐酸性黑曲霉菌株Aspergillus niger L.的菌丝体破碎液依次经过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等步骤处理,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE显示其分子质量为125.7kD。β-葡萄糖苷酶水解对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷的最适pH值为3.0～4.0,最适温度为70℃,表观米氏常数(Km)值为2.35mmol/L,表观kcat/Km值为2.99×104L/(mol.s);水解京尼平苷、水杨苷的表观kcat/Km值分别是1.26×104、1.37×104L/(mol.s);水解活性受Mn2+的显著激活和Fe2+、Zn2+、Cu2+等离子的微弱抑制。该酶活性在pH2.0～8.3保持稳定;酶在65℃时保温60min,残余酶活达到了85%,是一种热稳定酸性β-葡萄糖苷酶。

黑曲霉耐酸性α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

采用耐酸性黑曲霉(Aspergillus niger L.)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过聚乙二醇6000-KH2PO4双水相萃取、Sephadex G-100凝胶过滤,获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化倍数为36.4,总酶活力回收率达到70%。凝胶过滤表明:该酶表观分子质量为125kD,SDS-PAGE显示其分子质量为58.5kD。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.0,最适温度为65℃,表观Km值为0.915mmol/L,表观kcat/Km值为1.07×105L/(mol.s);水解蜜二糖的表观Km、kcat/Km值分别是21.0mmol/L、9.96×103L/(mol.s);对棉子糖只有微弱的水解作用。水解活性受多种金属离子的普遍抑制,其中Fe3+、Fe2+、Mn2+、Hg+等强烈抑制酶活力。该酶活力在pH1.5～8.2保持稳定,在60℃时保温60min,剩余酶活力达到了60%,是一种热稳定酸性α-半乳糖苷酶。

黑曲霉发酵豆渣产酸性β-葡萄糖苷酶及其水解京尼平苷的性质

利用单因素、正交试验考察了黑曲霉L菌株发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶的条件和酶解京尼平苷的特性。结果表明:2%豆渣适宜作为实验菌株液体发酵产酶培养基,当培养基中接种孢子浓度大于每毫升2×105个时,菌株产酶受发酵温度、装液量的影响显著,而不受接种量、摇床转速的影响,培养基初始pH值1.5时,菌株仍能正常产酶;优化的产酶培养基组成为豆渣1%、米糠1%和Tween 800.1%,初始pH值5.5;菌株在发酵温度28℃、装液量50 mL(250 mL摇瓶)、摇床转速150 r/min的发酵条件下发酵120 h,发酵液酶活为(200±10)U/mL。所产β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷的最适温度为55℃、最适pH值2.5、最佳水解时间15 min;在该条件下酶的表观米氏常数(Km)为1.35 g/L,最大水解速率(Vmax)为26.45 g/(L.min.mg),酶活半衰期为15 min,50℃时大于60 min;酶的水解活性受Na+、Ca2+的显著激活,受Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Hg+、Zn2+、Mn2+等离子(10 mmol/L)和葡萄糖、乙醇的抑制。

根霉A03α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质初步研究

根霉(Rhizopus sp.A03)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9%,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃,表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/K_m值为2.866×10~4 mol-1/(L·s);水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/(h·mg);水解活性受Fe^(3+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)和Hg^+等离子的强烈抑制,但Fe^(2+)对酶活性具有显著的激活作用。该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60min,残余酶活达到了77.4%。

具有溶菌酶的部分生物活性的α-乳清蛋白(^(32)His→Leu,^(33)Thr→Glu,^(103)Tyr→Ala)突变体

在溶菌酶催化机理以及α 乳清蛋白和溶菌酶同源比较的基础上 ,构建了含 3个突变点的α 乳清蛋白突变体 (H32L ,T33E ,Y10 3A) ,并将其克隆到具有T7启动子的表达质粒pET2 8a(+ )中 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3) /pLys中获得高效表达 .存在于包涵体中的目标蛋白经变复性并通过DEAESepharoseStreamline和SephacrylS2 0 0层析柱获得纯化蛋白 .合成底物 p Nitrophenyl β D N’ ,N’’ ,N’’’ Triacetyl chitotriose [pNP (NAcGlc) 3]与突变体蛋白的反应时间曲线证明突变体蛋白获得了部分溶菌酶生物活性 ,为重组鸡蛋清溶菌酶 (HEWL)的 5 .2 6 % .利用等温滴定量热法测定突变体蛋白与五糖底物chitopentaose的平均热结合能为 71.34kJ/mol,重组HEWL为 10 5 .4 7kJ/mol.实验表明 ,通过有限的几个突变就可以使α 乳清蛋白获得溶菌酶的活性 。

亳菊花中β-葡萄糖苷酶的提取和酶学性质研究

目的测定亳菊花中β-葡萄糖苷酶的活性，研究亳菊花中β葡萄糖苷酶的基本酶学性质。方法采用对硝基苯酚-β-D葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）法考察亳菊花中β-葡萄糖苷酶活性测定的最佳条件及其酶学性质。结果当0．2mL酶液、20mmol／L pNPG0．2mL、0．6mL pH值为4．0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液在温度为50℃的水浴中反应45min时，酶活性最高。在此条件下对亳菊花的粗酶液中8I葡萄糖苷酶的基本酶学性质进行初步研究，结果表明该酶在30～50℃时，随着温度升高，酶活力有上升趋势，其热稳定性较好；pH值在3．2～5．4之间时，相对酶活性均在80％以上；酶在4℃下的保存稳定性较好。结论本研究所测定的亳菊花中β葡萄糖苷酶活性的最佳条件及酶学性质可为亳菊花炮制原理研究奠定基础。

Structural changes of cellobiohydrolase I (1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase I, CBHI) and PNPC (p-nitro-phenyl-β-D-cellobioside) during the binding process

Conformational changes to 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase I (CBHI) in response to its binding with p-nitrophenyl β-D-cellobioside (PNPC) were analyzed by second-derivative fluorescence spectrometry at the saturation binding point. Irreversible changes to the configuration of PNPC during the course of the binding process were characterized by UV spectral analysis. Isothermal titration calorimetry (ITC) was used to determine the stoichiometry of binding (i.e. the number of molar binding sites) of PNPC to CBHI. Two points on the surface of the CBHI molecule interact with PNPC, and irreversible changes to the configuration of PNPC occur during its conversion to p-nitrophenyl (PNP). The ITC studies demonstrated that the binding of PNPC to CBHI is an irreversible process, in which heat is released, but where there is no reversible equilibrium between PNPC-CBHI and CBHI and PNPC. On the other hand, PNP and cellobiose need to be released from the PNPC-CBHI complex to facilitate the repeated binding of new PNPC molecules to the renewable CBHI molecules. Therefore, we speculate that the energy, which powers the configurational change of PNPC as it is converted to PNP, is generated from cyclic changes in the conformation of CBHI during the binding/de-sorption process. These new insights may provide a basis for a better understanding of the binding mechanism in enzyme-substrate interactions.

酶-底物PNP-Glucu Na的合成及快速检测的应用

对硝基苯βD葡糖苷酸钠盐(简称PNPGlucuNa)是葡糖苷酸酶的一种底物。该底物被大肠埃希氏菌(E.Coli)富含的葡糖苷酸酶分解而产生颜色,在405nm有吸收,来检测大肠杆菌。酶底物法检测大肠杆菌自80年代起至今,应用于食品饮料,各种水源及尿路感染的大肠杆菌检测[1～3]。这种新方...

黑曲霉水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

黑曲霉Aspergillus niger发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液依次经过乙醇沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析,获得了两种电泳纯的β-葡萄糖苷酶BGL1和BGL2,它们的相对分子质量分别为102kDa、97kDa,总酶活回收率达到48%。在pH2.5及温度为55℃时,两种BGL水解京尼平苷的速度均达到最大;BGL水解活性受到Na+的激活但不受K+的影响,但Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+和Hg+等离子对BGL活性有不同程度的抑制作用(其中对BGL1的抑制普遍强于BGL2),而且同一种离子对不同BGL活性的影响性质不同,Ca2+显著激活BGL1而对BGL2无影响,Fe3+显著抑制BGL1而激活BGL2。在同样条件下,BGL对对硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷(pNPGlu)、对硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷(pNPGal)和水杨苷均有催化活性,其中对pNPGlu的Km值最小,BGL1、BGL2分别为0.764和1.934mmol/L;而BGL对京尼平苷水解的催化效率最高,BGL1、BGL2的Kcat/Km值分别为4.28×104和1.04×105L/mol·s。BGL1、BGL2活性的pH稳定范围相近,分别为pH2.0-7.0、pH2.0-8.5,但它们的热稳定性差异较大,55℃时BGL2保温60min,酶活保留了60%,而BGL1的酶活半衰期只有10min。