木瓜蛋白酶体外对血小板聚集的抑制作用

目的:以洗涤血小板为模型,观察木瓜蛋白酶在体外对血小板聚集的抑制作用,以探讨其抗血栓作用的可能机制。方法:将不同剂量木瓜蛋白酶与洗涤血小板作用,以血小板聚集分析仪检测ADP、花生四烯酸(AA)、胶原和凝血酶诱导的血小板最大聚集率,以流式细胞仪检测活化血小板膜纤维蛋白原受体(FIB-R)和P-选择素表达水平,以SDS-PAGE分析血小板肌动蛋白聚合体的变化。检测ADP诱导的原发性高血压(PH)及急性心肌梗死(AMI)患者血小板最大聚集率和FIB-R表达水平。结果:木瓜蛋白酶剂量依赖性地抑制血小板聚集,降低血小板最大聚集水平,血小板聚集水平与木瓜蛋白酶剂量呈负相关(P<0.01)。木瓜蛋白酶剂量依赖性地抑制ADP诱导的血小板FIB-R表达,降低FIB-R表达水平(P<0.01)。木瓜蛋白酶降低ADP诱导的血小板膜P-选择素表达水平和抑制肌动蛋白聚合体增加(P<0.01)。木瓜蛋白酶抑制PH及AMI患者血小板聚集和FIB-R表达(P<0.01)。结论:木瓜蛋白酶通过抑制活化血小板膜纤维蛋白原受体的表达,并抑制肌动蛋白聚合以及释放反应从而剂量依赖性地抑制血小板的聚集反应,有抗血栓形成作用。

吗啡依赖大鼠不同脑区肌动蛋白及其结合蛋白的表达变化

目的研究吗啡依赖大鼠不同脑区肌动蛋白及其结合蛋白p-cofilin的表达变化。方法 42只♂SD大鼠,随机分为吗啡依赖1周组(M1组)、2周组(M2组)和4周组(M4组),各依赖组均设对照,每组7只。吗啡依赖组采用剂量递增法腹腔注射吗啡,每日3次,连续7 d,日剂量按5,10,15,20,30,40,50 mg.kg-1逐日递增,对照组给与等体积的生理盐水。M2和M4组大鼠继续分别给予50 mg.kg-1盐酸吗啡,每天1次,连续注射1或3周。在最后一次给药后5 h断头处死大鼠,迅速分离前额叶皮质、海马、纹状体和丘脑。Western blot检测吗啡依赖大鼠不同脑区肌动蛋白及其结合蛋白的表达变化。结果与对照组相比,M2和M4组大鼠前额叶皮质内F-actin/G-actin比值分别上调53%(P<0.05)和102%(P<0.01);M2和M4组大鼠前额叶皮质内p-cofilin表达量分别上调93%(P<0.01)和88%(P<0.01)。M4组大鼠海马中F-actin/G-actin比值上调94%;M2和M4组大鼠海马中p-cofilin蛋白表达量分别上调45%(P<0.05)和30%(P<0.05)。M2和M4组大鼠纹状体内p-cofilin的蛋白表达量分别下调25%(P<0.05)和30%(P<0.05)。结论长期吗啡处理可诱导大鼠形成依赖,伴随着依赖相关脑区肌动蛋白重构,并呈现脑区特异性和时间依赖性。

EZH2对HSC-T6细胞增殖活化的影响及其部分机制研究

目的探讨Zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)表达沉默对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞增殖活化的影响,及其部分调控机制。方法应用EZH2的抑制剂DZNep(3-Deazaneplanocin A)作用于TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞,采用Western blot法检测蛋白EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA的表达;根据EZH2的碱基序列设计并合成小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),通过脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞内,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSC-T6细胞的增殖变化,Western blot法检测蛋白EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA的表达。结果将DZNep加入TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞后,EZH2蛋白水平明显降低,同时p-ERK、pAKT和α-SMA蛋白水平亦明显降低;将EZH2-si RNA转染活化的HSC-T6细胞内,HSC-T6细胞的增殖可明显被抑制,同时EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白水平亦明显降低。结论抑制EZH2的表达可明显抑制HSC-T6细胞的增殖活化,EZH2可能是潜在的治疗肝纤维化的靶点。

hper1干扰质粒的构建及hper1功能的初步研究

目的构建高效的针对hper1(人类period1基因)的干扰质粒,并对hper1的功能进行初步研究。方法选择4个hper1的干扰位点,根据位点序列合成构建4个pTER-hper1干扰质粒,并通过测序验证。将4种干扰质粒分别转染至SH-SY5Y细胞,经马血清休克诱导后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测hper1mRNA的表达,鉴定干扰效果。提取细胞总蛋白,Western Blot检测P-p44/42丝裂原活化蛋白激酶(mitagen-actinated pratein kinase,MAPK)表达。结果RT-PCR鉴定显示pTER-hper1-Ⅱ干扰质粒干扰效率最高,hper1表达量降低84.9%。Western Blot显示hper1表达受抑制后,P-p44/42MAPK水平升高。结论成功构建并筛选到具有显著干扰效率的pTER-hper1干扰质粒,为进一步研究hper1的功能奠定了基础,并发现hper1对MAPK通路具有负相调控作用。

护肝片通过抑制肝纤维化而阻碍肝细胞癌发展

目的探讨在DEN诱导的大鼠肝癌模型中,护肝片在肝纤维化—肝癌发展过程中所产生的影响。方法雄性SD大鼠90只随机分为二乙基亚硝胺(diethylinitrosamine,DEN)组,正常对照组,护肝片组(921 mg·kg-1)。DEN组和护肝片组给予0.2%DEN溶液灌胃,按体重10 mg·kg-1给药,每周5次,至14周,对照组给予溶媒。护肝片组同时灌胃(ig)给予护肝片溶剂(羟甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配制),每日1次,直至16周。收集所有大鼠血液样本,进行血清学检测。通过病理组织学检查检测肝纤维化的程度。采用试剂盒检测肝组织中羟脯氨酸的含量。采用免疫组化法检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及胎盘型谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase placenta,GST-P)蛋白的表达。结果 DEN能够成功的诱导大鼠在12周发生肝纤维化,在16周发生肝癌。护肝片能够显著抑制肝纤维化—肝癌的发生。在12周时,护肝片能显著降低与肝功能相关的血清学指标以及α-SMA的过度表达,降低纤维化的程度。在16周时,护肝片能显著降低DEN诱导的大鼠肝癌的发生率和多样性。此外护肝片还能降低癌前病变指标γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyl transferase,GGT)和GST-P蛋白的表达。结论护肝片能够通过降低癌前病变指标GGT和GST-P的表达来阻止DEN诱导的肝癌的发生,同时也能减轻肝纤维化的程度,提示GGT与GST-P表达增强与肿瘤的发生密切相关,可能可以作为由纤维化进一步发展为肿瘤的标志,或者有可能成为预测肝癌发生的指标。

丹皮酚联合三七总皂苷对AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞增殖及TGF-β/Smads信号通路的影响

目的探讨丹皮酚联合三七总皂苷应用对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导新生大鼠的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖及TGF-β/Smads信号通路的影响。方法采用胰酶消化法分离培养的CFs随机分为6组:正常对照组,模型组,三七总皂苷组,丹皮酚组,丹皮酚与三七总皂苷联合用药大、小剂量组。采用MTT比色法测定各组培养液中CFs增殖情况,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平,RTPCR法检测转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,Tgfb1)的mRNA表达水平,Western blot法检测TGF-β1、磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)的蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型组大鼠CFs增殖明显增高,Tgfb1的mRNA表达显著增加,α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达显著增加;与模型组比较,丹皮酚组、三七总皂苷组、联合用药的大剂量和小剂量组均可抑制由AngⅡ诱导的CFs的增殖,Tgfb1的mRNA表达显著减少,α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达显著减少;与丹皮酚组、三七总皂苷组比较,联合用药大、小剂量组在抑制CFs增殖的作用上显著增强,抑制Tgfb1的mRNA表达效果显著增强,抑制α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达效果显著增强;与联合用药小剂量组比较,联合用药大剂量组对以上指标的抑制效果更佳,显示一定的剂量依赖性。结论丹皮酚与三七总皂苷联合应用对抑制CFs增殖,呈现明显的协同作用。其作用机制与抑制TGF-β/Smads信号通路的传导有关。

Wnt/β-catenin信号通路对日光性角化病相关基因蛋白表达的影响

目的 观察日光性角化病(AK)患者中Wnt/β-catenin信号通路的相关基因蛋白的表达情况,分析其在AK发病机制的作用。方法 回顾性分析资阳市第一人民医院2010年3月至2017年5月收治的45例AK确诊患者(AK组)、45例鳞癌患者(鳞癌组)以及50例健康人(正常组)的临床资料。然后对患者的石蜡组织标本进行组织学病理检查,分析AK组患者的病理学特点;通过免疫组织化学法检测组织细胞中的β-catenin以及降解基底膜的基质金属蛋白酶(MMP-2)的表达情况;运用RT-PCR的方法,检测与凋亡相关的Fas、Fas L以及细胞周期调节蛋白P-53相关基因的表达情况。结果 组织病理结果显示,AK患者组织真皮的浅层发生有嗜碱性病变,组织表皮的下层细胞排列紊乱。免疫组化结果显示,AK组、鳞癌组以及正常组MMP-2阳性分别为41例、35例、8例,β-catenin阳性分别为27例、12例、1例,Livin阳性分别为28例、15例、3例,Caspase-3阳性分别为25例、16例、2例;MMP-2、Livin、Caspase-3和β-catenin阳性率情况:AK组>鳞癌组>正常组,差异具有统计学意义(P <0. 05)。PCR结果显示,鳞癌组患者的Fas、Fas L以及P-53表达水平分别是AK组患者的0. 24、2. 92以及3. 47倍,且两组患者目的基因的△CT差异显著,具有统计学意义(P <0. 05)。结论 Wnt/β-catenin信号通路影响细胞中基质金属蛋白酶MMP-2、细胞凋亡相关基因(Fas、Fas L)和P53的表达,在AK的发病机制中起着重要的作用。

腺苷三磷酸对人横纹肌肉瘤细胞系P^(21)和c-myc蛋白表达的影响

为进一步研究腺苷三磷酸抑制癌细胞增殖诱导分化的作用机理，用ＡＴＰ作用于人横纹肌肉瘤单细胞克隆亚系ＲＤＬ６细胞，用免疫荧光细胞化学方法观察ＡＴＰ作用后的ＲＤＬ６细胞核内Ｐ２１蛋白表达增强，ｃ－ｍｙｃ蛋白表达降低，膜下胞质内微丝束－应力纤维组装改善，粘着斑内的主要粘附蛋白——纽蛋白（ｖｉｎｃｕｌｉｎ）表达增强，正常小鼠成肌细胞Ｃ２Ｃ１２细胞核内Ｐ２１蛋白高表达，ｃ－ｍｙｃ蛋白不表达。结果表明：ＲＤＬ６细胞Ｐ２１表达的丢失和ｃ－ｍｙｃ表达的活化与细胞的增殖和分化异常相关，从而表明Ｐ２１表达增强和ｃ－ｍｙｃ表达的降低在ＲＤＬ６细胞表型逆转过程中起重要作用。

硫化氢后处理对大鼠缺氧-复氧心肌细胞的保护作用

目的探讨硫化氢(H2S)后处理对缺氧-复氧损伤成年大鼠心肌细胞的影响,评价其心肌保护作用及其可能的机制。方法分离成年SD大鼠心肌细胞,随机均分为四组:正常组(N组)、缺氧-复氧组(HR组)、缺氧后处理组(IPTC组)和H2S后处理组(S组),在激光扫描共聚焦显微镜下检测F-肌动蛋白/G-肌动蛋白荧光强度及Western blot技术检测各组心肌细胞p38MAPK磷酸化(p-p38MAPK)水平;再将上述四组又分为加或不加细胞松弛素D(CyD)两个亚组,激光扫描共聚焦显微镜下检测细胞内Ca2+、pH值荧光强度。结果 HR组、IPTC组和S组F/G-肌动蛋白明显高于N组(P<0.05);IPTC组和S组F/G-肌动蛋白明显高于HR组(P<0.05),且S组明显高于IPTC组(P<0.05)。与无CyD处理比较,CyD处理时四组Ca2+荧光强度明显升高(P<0.05);N组与HR组pH荧光强度升高,IPTC组与S组pH荧光强度降低。无CyD处理时N组、IPTC组和S组Ca2+荧光强度明显低于、pH值荧光强度明显高于HR组(P<0.05);CyD处理后HR组、IPTC组和S组Ca2+荧光强度明显高于,IPTC组和S组pH值荧光强度明显低于N组(P<0.05)。心肌细胞内HR组p-p38MAPK水平明显高于N组、IPTC组和S组(P<0.05)。结论硫化氢后处理可以促进F-肌动蛋白的重塑,稳定缺血缺氧成年大鼠心肌细胞内环境;硫化氢后处理可降低缺血缺氧成年大鼠心肌细胞p38MAPK磷酸化水平。

A型肉毒毒素对兔耳增生性瘢痕组织中P物质、β1转移生长因子、α平滑肌肌动蛋白的影响

目的探讨A型肉毒毒素（botuliniumtoxintypeA，BTA）对兔耳增生性瘢痕组织中P物质（substanceP，SP）、β1转移生长因子（transforminggrowthfactorbeta一1，TGF—β1）和α平滑肌肌动蛋白（alphasmoothmusleactinA，αSMA）的影响及意义。方法12只日本大耳白兔，体重3kg，建立兔耳增生性瘢痕模型。将兔耳创面分为BTA注射组（I组）和瘢痕组（S组），每组72个创面。大体观察创面愈合时间和瘢痕增生情况，统计术后14d时的创面愈合率。术后28d时，同法另取6只兔子的兔耳腹面正常皮肤为空白对照组（C组），收集3组标本。实时定量PCR检测各组标本中SP、TGF-β1和α—SMA的mRNA含量，Western印迹法检测α—SMA的蛋白表达。结果（1）术后14d，Ⅰ组与S组的创面愈合率的差异无统计学意义；（2）1组SP和TGF一β1、α—SMA的mRNA含量较S组显著降低，但仍高于C组（P〈0．05）；（3）蛋白水平上，3组的α—sMA表达两组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05），且S组〉Ⅰ组〉C组。结论BTA注射不延迟创面愈合，并减少了兔耳增生瘢痕中SP、TGF-β1和α—SMA的mRNA表达，为其治疗增生性瘢痕的临床应用提供了一定的理论依据。