长链非编码RNA RP11-572P18.1对卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响及作用机制实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-572P18.1对卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制。方法:采用国际癌症基因组联盟(ICGC)数据库分析卵巢癌组织中RP11-572P18.1表达水平。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测卵巢癌细胞系OC3、A2780、Caov-3、SK-OV-3、HO-8910中RP11-572P18.1表达水平,选取表达水平最低的细胞进行后续实验。将Caov-3细胞分为RP11-572P18.1组和NC组,分别转染RP11-572P18.1过表达质粒和对照质粒。MTT实验检测Caov-3细胞增殖能力,Transwell实验检测Caov-3细胞侵袭能力。双荧光素酶报告基因实验验证RP11-572P18.1和miR-205-5p的靶向关系。采用RT-qPCR检测Caov-3细胞miR-205-5p表达。采用免疫印迹法(Western blot)检测Caov-3细胞增殖蛋白[细胞周期蛋白B(Cyclin B)、细胞周期蛋白E(Cyclin E)]和侵袭蛋白[锌指E盒同源结合蛋白1(Zeb1)、转录因子(Twist)、β-连环蛋白(β-catenin)]表达。结果:与正常组织比较,卵巢癌组织中RP11-572P18.1表达降低(P<0.01)。与正常卵巢上皮细胞IOSE80比较,卵巢癌细胞系中RP11-572P18.1表达水平降低,且Caov-3细胞降低最显著(均P<0.05)。与NC组比较,RP11-572P18.1组Caov-3细胞增殖能力及侵袭数目降低(均P<0.05)。RP11-572P18.1与miR-205-5p存在靶向关系。与NC组比较,上调RP11-572P18.1可抑制Caov-3细胞miR-205-5p以及Cyclin B、Cyclin E、Zeb1、Twist和β-catenin蛋白表达(均P<0.05)。结论:RP11-572P18.1在卵巢癌组织和细胞系中表达降低,RP11-572P18.1通过下调miR-205-5p抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭。

褪黑素受体激动剂Neu-P11对兔眼组织AQP1表达的影响

水通道蛋白1（aquaporin1，AQP1）在眼内组织分布较广，其与房水的分泌、排出及调节关系密切；褪黑素受体激动剂5-MCA—NAT能降低实验兔眼压；Neu-P11是一种高效的非选择性褪黑素受体激动剂，能激活褪黑素受体，从而起到类似褪黑素的作用；

海马脑源性神经营养因子p11信号通路参与氯胺酮抗抑郁作用

目的探讨海马中脑源性神经营养因子(BDNF)-p11信号通路是否参与氯胺酮抗抑郁作用。方法 48只健康成年雄性SD大鼠随机分为四组(n=12):对照组(C组)、慢性不可预知温和应激组(CUMS组)、CUMS+氯胺酮组(K组)及CUMS+氯胺酮+ANA-12组(KA组)。CUMS组、K组和KA组通过CUMS建立抑郁模型,K组和KA组分别腹腔注射氯胺酮10mg/kg及氯胺酮10mg/kg+ANA-12 0.5mg/kg,C组和CUMS组注射等容生理盐水。给药后0.5h和3d进行旷场实验、强迫游泳实验、蔗糖偏好实验,观察大鼠行为学改变。行为学结束后,每组取6只大鼠海马组织,测定BDNF及p11表达水平。结果旷场实验中,四组大鼠运动总距离差异无统计学意义。给药后0.5h和3d,与C组和K组比较,CUMS组和KA组不动时间明显延长(P<0.05)。给药后3d,与C组和K组比较,CUMS组和KA组蔗糖消耗百分比明显减少(P<0.05)。给药后0.5h和3d,与C组比较,CUMS组海马BDNF及p11表达水平明显减少;与CUMS组比较,K组海马BDNF表达水平明显增加(P<0.05)。给药后3d,与K组比较,CUMS组和KA组海马p11表达水平明显减少(P<0.05)。结论海马中BDNF-p11信号通路可能参与维持氯胺酮的抗抑郁作用。

新型褪黑素受体激动剂Neu-p11对缺血/再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的研究Neu-p11预处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤细胞凋亡的影响。方法 30只♂SD大鼠随机分为3组:假手术组,缺血/再灌注损伤组和Neu-p11预处理组。测定血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的活性及心肌丙二醛(MDA)的含量,TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,免疫印迹法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果 Neu-p11预处理可明显改善缺血/再灌注损伤大鼠的心功能损害,减少血清中LDH、CK的释放和心肌组织中MDA的产生,可使心肌细胞凋亡率减少,心肌Bcl-2蛋白表达上调,Bax蛋白表达下调。结论 Neu-p11对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用,其机制可能与抑制细胞凋亡有关。

中国恒河猴Mamu-A^＊01基因筛查及其对抗原肽p11C的特异性CTL反应

目的筛查中国恒河猴Mamu-A*01基因,比较中国恒河猴和印度恒河猴的Mamu-A*01基因序列和功能是否相同。方法PCR方法检测128只中国恒河猴,用特异性引物扩增Mamu-A*01基因,将PCR扩增后的产物克隆测序后与印度恒河猴的Mamu-A*01基因进行同源比对;酶联免疫斑点检测(ELISPOT)方法分别检测5只Mamu-A*01基因阳性和5只阴性恒河猴针对SIV、SHIV抗原肽p11C的特异性CTL反应。结果共筛查出5只Mamu-A*01基因阳性恒河猴(3.91%),经测序分析后与印度恒河猴的同源性可达99.1%。这5只均为SIV/SHIV感染恒河猴,其中四只SIV感染的猴的ELISPOT结果显示针对p11C的高频CTL反应,斑点数在500-1400/106PBMCs之间,而另1只SHIV感染的恒河猴及5只阴性猴没有斑点出现。结论中国恒河猴含有Mamu-A*01基因,基因频率有区域性差异,中国恒河猴的Mamu-A*01可提呈特异性抗原肽p11C。

启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。

发酵床饲养方式对猪情绪因子及抗抑郁因子P11基因mRNA表达的影响

【目的】本文探讨了饲养模式对猪血清情绪相关物质(5-羟色胺5-HT、β-内啡肽β-EP、皮质酮Cortisol等)及抗抑郁因子P11基因mRNA表达的影响。【方法】试验选择60头体况良好、体重相近(28.4±0.30)kg 60日龄苏钟猪(阉割,公母各半)作为试验动物,随机分为2组:发酵床饲养组(垫料基质为菌糠)、水泥地面饲养组,每组3个重复,每个重复10头,试验期90 d(育肥前期、后期)。试验第45、90天采集血液测定血液情绪物质,90 d屠宰取下丘脑组织,用于p11蛋白RT-PCR检测。【结果】(1)唾液中,发酵床饲养组5-HT、Cortisol浓度显著高于水泥地面饲养组(P<0.05),β-EP、乙酰胆碱(Ach)浓度则无显著差异(P>0.05)。(2)血清指标方面,育肥前期(试验第45天)发酵床饲养组猪血清β-EP、Cortisol、锌(Zn)浓度显著高于水泥地面饲养组(P<0.05),5-HT、Ach浓度有提高的趋势(P=0.065,P=0.062),镁(Mg)浓度则无显著差异(P>0.05);育肥后期(试验第90天),发酵床饲养组猪血清β-EP、cortisol、5-HT浓度显著高于水泥地面饲养组(P<0.05),Ach浓度与前期结果相反,则显著低于水泥地面饲养组(P<0.05),Zn、Mg浓度则无显著差异(P>0.05)。(3)RT-PCR检测结果显示,发酵床饲养组下丘脑P11蛋白基因mRNA相对表达量高于水泥地面饲养组,且有提高趋势(P=0.062)。【结论】发酵床模式可以显著提高猪机体的情绪物质的分泌,促进脑分泌抗抑郁P11蛋白,减少生理应激,趋于愉悦状态,改善动物福利,促进健康。

Neu-P11对急性高眼压大鼠眼压及视网膜组织胶质原纤维酸性蛋白表达的影响

目的探讨Neu-P11对急性高眼压大鼠眼压及视网膜胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)表达的影响。方法24只雄性SD大鼠随机分为:正常对照组、高眼压组、褪黑素治疗组和Neu-P11治疗组,每组6只,后3组采用Trendelenburg卧位法建立高眼压模型,各组通过眼角膜滴注方法给药。正常对照组和高眼压组滴注10μL生理盐水,褪黑素治疗组和Neu-P11治疗组分别滴注10μL 100μmol·L^(-1)褪黑素和NeuP11药物治疗,给药后休息2 h,再次置于卧位45 min后每小时测1次眼压,共6次,观察1周,重复实验1次。实验末注射过量戊巴比妥钠处死大鼠,留取各组大鼠眼球常规组织学切片观察SD大鼠视网膜形态学变化;免疫组织化学染色观察视网膜GFAP的表达。结果正常对照组眼压为(13.61±0.55)mmHg(1 kPa=7.5 mmHg),高眼压组眼压为(41.26±1.73)mmHg(P<0.01),即急性高眼压大鼠模型建立成功。与正常对照组相比,高眼压组大鼠视网膜水肿增厚,层次不清晰,GFAP表达呈强阳性。而褪黑素治疗组和Neu-P11治疗组大鼠眼压较高眼压组显著降低,GFAP蛋白阳性表达明显减弱。结论Neu-P11能够降低急性高眼压大鼠眼压,抑制视网膜组织胶质细胞的激活,降低GFAP表达,保护视网膜。

Neu-P11通过抑制氧化应激降低急性高眼压大鼠眼内压

目的褪黑素(melatonin,Mel)是由松果体分泌的一类吲哚类神经内分泌激素,具有调节昼夜节律和抗氧化等广泛的生物学作用。新型褪黑素非选择性受体激动剂NeuP11与褪黑素作用相似。该文旨在研究Neu-P11对急性高眼压大鼠眼内压的影响及其相关机制。方法采用Trendelenburg卧位(头低脚高80°位置)法将30只健康8周龄SD大鼠建立急性高眼压模型,即动物被置于Trendelenburg卧位,用Tonopen XL接触眼压计每5 min测量1次眼内压,取20 min最大值。建模后将大鼠随机分为5组:正常眼压+生理盐水组、高眼压+生理盐水组、高眼压+10 mg·kg^(-1)Mel组、高眼压+20 mg·kg^(-1)Neu-P11组、高眼压+50 mg·kg^(-1)Neu-P11组,每组6只。给药后平位休息2 h,再次置于Trendelenburg卧位45 min后,连续监测6 h眼内压(每小时1次)。连续给药1周后,注射过量戊巴比妥钠处死SD大鼠,心脏取血,检测急性高眼压大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px的活性;留取各组大鼠眼球进行常规组织学切片,观察SD大鼠视网膜形态学变化。结果 Trendelenburg卧位诱导模型组大鼠眼内压值比正常组升高了约202.9%(P<0.01),且视网膜增厚,层次不清,机体氧化应激水平明显升高。而经Neu-P11和褪黑素治疗后,明显改善了机体氧化应激水平和视网膜水肿,降低大鼠眼内压。结论 Neu-P11可能通过抑制机体氧化应激水平,降低急性高眼压大鼠眼内压。

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的 :表达GST p11和 6xHis p11融合蛋白并制备GST p11特异性抗体。方法 :将人p11基因克隆入两种原核表达载体pGEX 4T 2和pQE30 ,分别在大肠杆菌BL2 1和M15中表达 ,用GlutathioneSepharose 4B和Ni NTAagar ose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST p11蛋白制备多克隆抗体。结果 :得到高表达量的融合蛋白 ,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST p11和 6xHis p11蛋白。以GST p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体 ,Westernblotting证实该抗体能够识别 6xHis p11蛋白 ,具有较高特异性。结论 :利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性 。

新型褪黑素受体激动剂Neu-P11改善慢性睡眠限制大鼠胰岛素敏感性

目的研究新型褪黑素(melatonin,MLT)受体激动剂Neu-P11对睡眠限制大鼠胰岛素敏感性的影响。方法采用转笼法对SD大鼠进行8 d的睡眠限制,期间每天分别给予腹腔注射Neu-P11(20 mg·kg-1)、MLT(5 mg·kg-1)、生理盐水。监测各组大鼠体重和耗食量,实验末测定空腹血糖、胰岛素、TG、TC、HDL-C水平,进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)。结果睡眠限制后大鼠空腹血糖、血清胰岛素和TG、TC水平明显高于正常对照组,HDL-C水平及葡萄糖耐量降低;而与睡眠限制组比较,Neu-P11或MLT处理组血糖、血清胰岛素、TG、TC水平及HOMA-IR降低、葡萄糖耐量升高。结论 Neu-P11能调节睡眠限制大鼠的糖脂代谢,改善睡眠限制引起的胰岛素抵抗。

Neu-P11对急性高眼压大鼠视网膜AQP4表达及眼内压的影响

水通道蛋白4（aquaporin4,AQP4）是视网膜上重要的水通道蛋白之一,参与房水的分泌和排出,有调节眼内水、电解质运输平衡的功能.褪黑素（melatonin,Mel）是松果体合成分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,可以作为黄斑变性、青光眼以及心血管疾病的一种辅助治疗药物,具有降低眼内压（intraocular pressure,IOP）的作用.

瘢痕疙瘩候选基因与染色体7p11微卫星扫描及连锁分析的多家系研究

目的:从与瘢痕疙瘩发病可能存在密切关系的基因出发,分析中国汉族瘢痕疙瘩家系致病基因与染色体7p11区域是否存在连锁关系,以定位易感基因位点。方法:采用微卫星扫描及连锁分析方法,选取3个中国汉族瘢痕疙瘩家系中69名成员的外周静脉血标本,根据文献选择位于7p11区域4个微卫星标记,应用多重聚合酶链式反应(mPCR)扩增产物片断,测定PCR产物片段,获得每个样本的基因分型。运用连锁分析软件LINKAGE的MLINK程序计算每个标记位点的LOD值,根据两点间LOD值判断是否存在连锁关系。结果:在重组率θ=0～0.5时,这些微卫星标记的两点LOD值绝大部分都小于1,排除连锁关系存在。结论:中国汉族瘢痕疙瘩家系易感基因位点不在染色体7p11区域。说明瘢痕疙瘩易感基因位点存在异质性。

褪黑素受体激动剂Neu-P11对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞IRS-1和GLUT-4表达的影响

目的探讨褪黑素受体激动剂Neu-P11对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞IRS-1和GLUT-4表达的影响。方法用高糖高胰岛素作用3T3-L1脂肪细胞24 h,建立胰岛素抵抗细胞模型。分别采用褪黑素、Neu-P11、褪黑素+luzindole(褪黑素受体拮抗剂)和Neu-P11+luzindole处理细胞,并以未加药细胞作为对照。用葡萄糖氧化酶法检测培养液中的糖含量并计算糖消耗量,用蛋白质印迹分析检测细胞内IRS-1、GLUT-4蛋白表达变化。结果胰岛素抵抗细胞用褪黑素和Neu-P11处理后,糖消耗量较未加药对照组升高(P<0.05),GLUT-4、IRS-1的蛋白表达也增高(P<0.05);褪黑素和Neu-P11分别与luzindole联合作用于细胞后,细胞的上述蛋白表达较单用褪黑素组和单用Neu-P11组降低(P<0.05),而与未加药对照组相比差异无统计学意义。结论褪黑素受体激动剂Neu-P11可提高胰岛素抵抗脂肪细胞的胰岛素敏感性,增加糖消耗量,这种作用可能与上调IRS-1、GLUT-4蛋白的表达有关。

罕见表型的8p11骨髓增殖综合征的特征

目的:提高对罕见表型的8p11骨髓增殖综合征(eight p11 myeloproliferative syndrome,EMS)临床表现、实验室检查特征、诊断及治疗的认识。方法:总结1例罕见累及T/B/髓三系的EMS病例临床、实验室特征及接受异基因造血干细胞移植治疗过程,同时结合既往文献报道的2例类似病例进行讨论。结果:患者骨髓检查表现为急性B淋巴细胞白血病,淋巴结活检提示T淋母/髓系双表型淋巴瘤,骨髓染色体检查发现8p11异常,RT-PCR检查提示BCR-ABL融合基因阴性,淋巴结FGFR1探针FISH提示存在FGFR1断裂,全外显子测序提示,FMNL3、NBPF1及RUNX1基因存在突变,患者在CR2状态下接受同胞全相合异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT),随访至2019年9月,患者仍无病存活。结论:EMS同时出现T系、B系及髓系的受累极其罕见,虽然可以进行针对FGFR1基因进行靶向治疗,但仍需积极考虑allo-HSCT。

柞蚕核型多角体病毒p11基因克隆及序列分析

为丰富柞蚕核型多角体病毒分子生物学基础，通过PCR扩增克隆了ApNPV p11基因并进行了序列的生物信息学分析。ApNPV p11基因编码102个氨基酸，预测分子量11．2kDa；氨基酸序列N端1～33位是信号肽序列，中部50～72位是跨膜区。PSI—BLAST搜索表明有20种核型多角体病毒编码蛋白与ApNPVP11蛋白有显著性匹配；比对分析发现P11蛋白氨基酸序列中部相对保守，两端变异较大。进化分析表明ApNPV属于NPV类群I且与EppoNPV、AgMNPV、CfDefNPV亲缘关系较近。

新型褪黑素受体激动剂Neu-P11激活AMPK减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的研究新型褪黑素受体激动剂Neu-P11对心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用及分子机制。方法实验分为对照组、缺氧/复氧模型组(H/R组)、H/R+Neu-P11组、H/R+Compound C组、H/R+Neu-P11+Compound C组。构建H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型,检测各组心肌细胞凋亡情况,细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、SOD活性及MDA含量及心肌细胞AMPK的活性。结果与缺氧/复氧组细胞相比,Neu-P11预处理组细胞凋亡率明显减少,CK、LDH、MDA含量明显下降,SOD活性增加,心肌细胞AMPK活性明显增高,而AMPK特异性抑制剂Compound C可以阻断Neu-P11的保护作用。结论 Neu-P11能够减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,这一保护作用与激活AMPK有关。

外源性层粘素P11片段对胆管癌细胞浸润能力的影响

目的：探讨层粘素 Ｐ１１ 活性片段对胆管癌细胞浸润过程的影响及可行的抗浸润治疗途径。方法：以层粘素 Ｐ１１ 片段处理 Ｑ Ｂ Ｃ９３９ 胆管癌细胞，观察胆管癌细胞分泌Ⅳ型胶原酶、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物的变化，并利用人羊膜浸润培养系统观察胆管癌细胞浸润能力的改变。结果：与层粘素整体分子相反，层粘素 Ｐ１１ 片段能够显著抑制胆管癌细胞分泌Ⅳ型胶原酶和体外浸润能力，但对尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物的分泌无明显影响。结论：层粘素可能通过胆管癌细胞膜细胞表面 Ｌ Ｎ 受体刺激Ⅳ型胶原酶分泌，介导胆管癌细胞浸润和转移过程。而浸润和转移过程中另一重要蛋白酶尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物的分泌调节，可能通过其它途径实现。研究阻断层粘素与层粘素受体结合的治疗方法，可能在未来临床防治肿瘤浸润和转移治疗中具有光明前景。

T7噬菌体衣壳蛋白P11的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:表达、纯化T7噬菌体衣壳蛋白P11,并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:克隆并表达T7噬菌体P11蛋白,其氨基端带有6-His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb。结果:成功表达了P11蛋白。SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为27000。获得了1株稳定分泌抗P11抗体的杂交瘤细胞株(2G11),其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b。ELISA检测,对应腹水mAb的效价为1∶8.1×105。Western blot结果显示抗P11mAb具有良好的特异性。结论:成功地制备了P11蛋白及其mAb。

电针对慢性社交挫败抑郁模型小鼠行为学及脑组织p11、5-HTR4表达的影响

目的观察电针对慢性社交挫败抑郁模型小鼠脑组织p11和5-羟色胺受体4(5-HTR4)表达的影响,探讨电针改善小鼠抑郁症的可能机制。方法40只C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、假针组和电针组,每组10只。采用定期社交行为应激建立慢性社交挫败抑郁模型,电针组于“百会”“印堂”行电针干预,每日1次,每次15 min,每周5次,连续3周,假针组处理方法与电针组相同,但毫针不刺入皮肤,对照组和模型组仅捆绑固定相同时间,不进行干预。采用糖水实验、旷场实验、社交行为测试和强迫游泳实验评价小鼠行为学变化,RT-PCR检测小鼠中缝核p11 mRNA表达,Western blot检测小鼠海马组织5-HTR4蛋白表达。结果与对照组比较,模型组小鼠社交指数、糖水偏好百分比明显降低(P<0.01),强迫游泳实验不动时间明显延长(P<0.001),旷场实验直立次数、中央距离和中央时间明显减少(P<0.01,P<0.001),中缝核p11 mRNA和海马组织5-HTR4蛋白表达明显降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠社交指数、糖水偏好百分比明显升高(P<0.05),强迫游泳不动时间明显缩短(P<0.01),旷场实验中央时间明显增加(P<0.01),中缝核p11 mRNA和海马组织5-HTR4蛋白表达明显升高(P<0.05);与假针组比较,电针组小鼠糖水偏好百分比明显升高(P<0.05),强迫游泳不动时间明显减少(P<0.05)。结论电针可能通过上调慢性社交挫败抑郁模型小鼠中缝核p11 mRNA表达,促进5-HTR4在谷氨酸能神经元质膜上表达,进而改善小鼠抑郁样行为。