GST-P12融合蛋白的抗体制备、鉴定及免疫组化分析

目的:为了进一步研究p12DOC-1基因及其蛋白在口腔癌发生中的作用与调控机制,将已表达纯化好的GST-p12融合蛋白进行多克隆抗体的制备及鉴定。方法:将构建好的融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1转化BL21(DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,得到GST-p12融合蛋白,经亲和层析柱纯化后电泳,再割胶研磨作为抗原直接免疫家兔,经Western blot及ELISA检测抗体效价及特异性并做免疫组化分析。结果:得到较高纯度的GST-p12融合蛋白,获得了兔来源的抗p12DOC-1血清,经蛋白免疫印迹杂交反应及免疫组化分析证实所得的抗体具有较高的特异性和效价。结论:成功制备了兔抗人的p12DOC-1抗血清,为进一步研究p12DOC-1在口腔癌中发生缺失的机理打下基础。

人CDK2-AP1(DOC-1)酵母双杂交诱饵质粒自激活作用鉴定

目的验证诱饵质粒pBD-DOC-1在酵母双杂交系统的自激活性及毒性作用,为应用酵母双杂交系统(yeasttwo-hybrid system)筛选与p12DOC-1/CDK2-AP1相互作用的蛋白建立实验基础。方法将诱饵质粒pBD-DOC-1转化到酵母细胞MAV203中,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活作用。同时利用对照质粒组筛选组氨酸(His)本底表达抑制剂3AT(3-氨基-1,2,4-三唑)的合适工作浓度。结果诱饵质粒pBD-DOC-1成功转化到酵母细胞MAV203中,对宿主酵母细胞无毒性,对报告基因无自激活作用。确定了组氨酸(His)本底表达抑制剂3AT(3-氨基-1,2,4-三唑)的合适工作浓度。结论诱饵质粒pBD-DOC-1可以用于酵母双杂交实验,为进一步运用酵母双杂交技术在人类组织cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。