胰腺癌PC-3细胞株外源性p14ARF抑癌基因表达与内源性p53表达水平的关系

目的 探讨外源性 p1 4ARF基因表达于胰腺癌PC 3细胞后与另一重要细胞周期调控蛋白 p53表达水平的相互关系。 方法 将含人 p1 4ARFcDNA的重组质粒通过脂质体介导转染入胰腺癌PC 3细胞中 ,并筛选出阳性克隆 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblot法检测PC 3细胞转染前后p1 4ARF的mRNA及蛋白的表达 ,同时用Westernblot分析其内源性 p53蛋白表达水平的变化。噻唑蓝 (MTT)比色法测定PC 3细胞在转染前、后的生长曲线变化。结果 胰腺癌PC 3细胞中p1 4ARF基因缺失。外源性 p1 4ARF基因成功转染入PC 3细胞并获得 1 4× 1 0 3大小的p1 4蛋白表达 ,且内源性 p53蛋白表达水平在转染后明显增高。PC 3细胞在导入 p1 4ARF基因后第 1天及第 5天的生长抑制率分别为 2 2 %及 2 6 % ,两者差异有显著性 (P <0 .0 5)。结论 p1 4ARF基因可上调胰腺癌PC 3细胞的内源性p53蛋白表达水平 ,从而发挥其细胞周期阻滞功能。

p14^(ARF)基因抑制喉癌细胞生长及其对内源性p53表达的影响

目的 探讨p14ARF对喉癌细胞生长的抑制作用及其对内源性p5 3表达的影响 ,为喉癌致癌的分子机理和基因治疗提供理论基础。方法 采用基因转染技术 ,将全长野生型p14ARF 互补DNA(complementaryDNA ,cDNA)转染到人喉鳞状细胞癌Hep 2细胞中 ,利用流式细胞仪、聚合酶链反应(polymerasechainreaction ,PCR)和Western Blotting等方法研究其对细胞周期、内源性野生型p5 3表达的影响。结果 转染p14ARF基因的Hep 2细胞的生长受到明显抑制 ,其克隆形成能力为转染空载体的5 7%。细胞分析表明 ,转染p14ARFcDNA 48h后 ,处在G0 G1和G2 M期的细胞皆增加了 1倍。同时Western Blotting分析结果表明 ,内源性野生型p5 3表达明显上升。结论 p14ARF 基因能上调Hep 2细胞中内源性野生型p5 3的表达并阻滞细胞于G0 G1和G2 M期 ,从而抑制其生长。

p14^(ARF)、p53抑癌基因与胰腺癌发生、发展的相关研究

目的 :研究抑癌基因p14 ARF、p5 3在胰腺癌组织中的表达和胰腺癌细胞株PC 3转染p14 ARF基因前后的生长状况 ,探讨它们对胰腺癌发生、发展的影响。方法 :采用免疫组织化学法检测 10例正常胰腺组织、4 2例胰腺癌组织中p14 ARF蛋白、p5 3蛋白的表达。将外源性p14 ARFcDNA重组质粒pCI neo p14 ARF和空载体质粒pCI neo分别转染入胰腺癌PC 3细胞中 ,观察转染后胰腺癌PC 3细胞株的生长状况。结果 :正常胰腺组织中p14 ARF的表达率为 90 % ,胰腺癌组织中为 35 .7% ;正常胰腺组织中p5 3的表达率为 0 ,胰腺癌组织中为 4 5 .2 %。胰腺癌PC 3细胞的p14 ARF基因呈缺失变异。外源性野生型p14 ARF基因和空载体质粒pCI neo成功转染入PC 3细胞 ,转染p14 ARF基因的胰腺癌细胞株第 1天生长抑制率为 2 2 % ,第 5天为 2 6 %。结论 :抑癌基因p14 ARF蛋白在胰腺癌中低表达 ,突变型p5 3蛋白在胰腺癌中呈高表达 ;转染p14 ARF基因的胰腺癌细胞株生长受到抑制 ;抑癌基因p14 ARF、p5 3对胰腺癌的发生、发展可能产生影响。

抑癌基因p14^(ARF)对慢性粒细胞白血病细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响机制研究

目的探讨抑癌基因p14ARF对慢性粒细胞白血病细胞的增殖、细胞周期及凋亡的的影响机制研究。方法应用慢病毒载体系统,将抑癌基因p14ARF导入慢性粒细胞白血病细胞系及患者来源的慢性粒细胞白血病细胞中,应用WST-8法检测细胞生长存活率,应用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果应用表达p14ARF的VSV-G假构型慢病毒载体可明显抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖,诱导细胞凋亡,但对细胞周期没有明显的影响。结论利用p14ARF基因治疗可明显抑制慢性粒细胞白血病细胞的增殖。

野生型p14ARF基因转染对人肺癌细胞生长抑制的实验研究

目的 探讨外源性p14ARF基因能否对体内外生长的肺癌细胞起抑制增殖的作用。方法 选择 4株具有不同基因背景的肺癌细胞系 ,转染人的野生型p14ARF基因。通过RT PCR、免疫组化及Westernblot杂交检测 ,筛选出同时表达p14ARFmRNA及蛋白的阳性克隆。以母细胞及转染空载体细胞为对照 ,比较它们的增殖、细胞周期分布、裸鼠体内成瘤性以及形态学上的差异。结果 三株具有野生型p5 3基因的肺癌细胞在转染p14ARF基因后 ,细胞周期被显著阻滞于G1或G1/G2期 ,增殖受到抑制。结论 外源性野生型p14ARF基因转染能抑制人肺癌细胞的增殖 ,p14ARF基因是人肺癌基因治疗的理想候选基因。

肺鳞癌、腺癌中p14^(ARF)基因启动子区甲基化及蛋白表达的研究

背景与目的p14ARF基因是新近发现的抑癌基因,其异常表达与多种人类肿瘤发生有关,启动子区异常甲基化作为p14ARF基因失活的重要形式可能参与了肿瘤的发生。本研究通过检测肺鳞癌、腺癌中p14ARF启动子区甲基化状态和蛋白表达,探讨p14ARF启动子区甲基化与肺癌的关系。方法通过免疫组织化学(I HC)、甲基化特异性PCR(MSP)和相关限制性内切酶PCR(RE-PCR)方法,检测40例肺鳞癌、腺癌组织中p14ARF启动子区甲基化状态和蛋白表达水平。结果癌组织及癌旁正常组织中p14ARF启动子区甲基化阳性率分别为17.5%(7/40)和2.5%(1/40)(P=0.025)。RE-PCR检测结果相同。癌组织及癌旁正常组织中p14ARF蛋白阳性率分别为70.0%(28/40)和95.0%(38/40)(P=0.003)。p14ARF基因启动子区甲基化和蛋白表达均与肿瘤分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移等临床病理特征无明显关系(P>0.05)。p14ARF启动子区甲基化与蛋白表达呈负相关(r=-0.56,P=0.001)。结论启动子区甲基化是p14ARF基因失活的重要机制。p14ARF启动子区异常甲基化可能参与了非小细胞肺癌的发生,是肺癌发生过程的早期事件。

p14^(ARF)基因抑制肿瘤细胞增殖的研究

目的 :从正常人肝细胞系L0 2细胞中扩增人的肿瘤抑制基因 p14 ARF,以研究其对人的多种肿瘤细胞生长的影响。方法 :应用RT -PCR技术 ,从培养的正常人肝细胞系L0 2细胞中扩增出 0 .4Kb的p14 ARFcDNA片段 ,测序正确后插入真核表达载体 pcDNA3上的BamHI和EcoRI位点 ,命名为 pcDNA3ARF。此质粒由脂质体Lipofec tamineTM介导转染肿瘤细胞Hep2、KB、KB -v2 0 0、HepG2、HLE、Huh7以及MCF7和MCF7/ADR ,经G4 18筛选 2周后统计形成的集落数。结果 :经抗生素G4 18筛选 2周后 ,发现p5 3阳性的肿瘤细胞HepG2、Hep2、MCF7形成的集落数较少 ,分别为 5 9± 2 .1,60± 2 .1和 66± 7.0 ,占各自对照组的 4 7% ,5 7% ,5 8% ;而 p5 3异常的肿瘤细胞KB ,HLE ,Huh - 7,则形成相对较多的集落 ,分别为 91± 2 .5 ,4 8± 2 .0 ,4 1± 2 .0 ,占各自对照组的 74 % ,65 % ,80 % ,但是二种p5 3异常的耐药肿瘤细胞株KB -v2 0 0和MCF7/ADR ,形成的集落数最少 ,分别为 13± 2 .0和 2 1± 1.5 ,占各自转染空载体 pcDNA3的对照组的 15 %和 17%。 结论 :p14 ARF能明显抑制 p5 3阳性肿瘤细胞的生长 ,具有 p5 3相关性 ;然而 p14 ARF对 p5 3阴性的耐药肿瘤细胞却具有强烈的抑制作用 ,由此提示 :p14 ARF抑制耐药肿瘤细胞的生长是 p5

肺癌p14ARF和p16INK4a基因协同表达缺失及其意义

目的 :研究抑癌基因位点INK4a ARF在肺肿瘤细胞中的表达状况 ,揭示p14ARF和p16INK4a协同表达缺失与肺癌发生发展的相关性。方法 :用RT PCR和Westernblot对 6株肺癌细胞 (SPC A 1,Calu 1,H44 6 ,SH77,A5 49,H46 0 )的INK4a ARF基因位点在mRNA、蛋白质水平上进行检测 ,对PCR产物进行纯化和测序分析。结果 :6株肺癌细胞中 ,有 3株细胞 (H46 0 ,Calu 1,A5 49)的p16INK4a基因表达缺失 ,其中 ,Calu 1表达正常p14ARF的mRNA ,而在H46 0和H5 49这两株非小细胞肺癌中 ,p14ARF和p16INK4a发生协同表达缺失。结论 :p14ARF基因与p16INK4a一样 ,是肺肿瘤细胞中的失活靶点之一。揭示了p14ARF缺失导致p5

肝细胞癌中p14^(ARF)基因启动子甲基化及蛋白表达的研究

目的通过检测肝细胞癌中p14ARF基因启动子甲基化状态与蛋白表达的关系,探讨p14ARF基因启动子甲基化与肝细胞癌的关系。方法通过甲基化特异性PCR(MSP)方法及免疫组化(IHC)法分别检测50例肝细胞癌组织和癌旁组织中p14ARF基因启动子甲基化状态和蛋白表达水平。结果癌组织及癌旁组织中p14ARF基因启动子甲基化阳性率分别为28%(14/50)和4%(2/50)(P<0.01)。癌与癌旁组织p14ARF蛋白表达差异极显著(P<0.01)。p14ARF基因启动子甲基化和蛋白表达与临床分期、门脉癌栓、术后复发、肝外转移、肿瘤大小、肿瘤个数及血清AFP值无关,而在肿瘤分化程度上p14ARF蛋白表达有显著差异,p14ARF基因启动子甲基化则无差异。p14ARF基因启动子甲基化与蛋白表达呈负相关。结论启动子区甲基化是p14ARF基因失活的重要机制。p14ARF启动子区异常甲基化可能参与了肝癌的发生、发展,在肝癌的进展中起重要作用。

甲状腺乳头状癌中P14^(ARF)基因启动子甲基化及蛋白的表达及意义

目的探讨甲状腺乳头状癌中P14ARF基因启动子甲基化及蛋白的表达及意义。方法应用QRT-PCR、甲基化特异性PCR(MSP)、免疫组织化学SP法分别检测人甲状腺乳头状癌及正常甲状腺组织标本中P14ARF基因及其蛋白的表达情况和P14ARF的甲基化状况并对比研究其生物学意义。结果 QRT-PCR检测显示甲状腺乳头状癌组织中P14ARFmRNA的表达明显低于对照组;免疫组织化学结果显示P14ARF蛋白在甲状腺乳头状癌中低表达;MSP检测结果示P14ARF启动子在甲状腺乳头状癌中过度甲基化。P14ARF及其蛋白的表达在甲状腺乳头状癌和对照组之间有统计学显著差异(P<0.05)。结论在甲状腺乳头状癌组织中P14ARF基因及其蛋白均呈现低表达,提示P14ARF基因在甲状腺乳头状癌发生发展中起抑癌作用,其低表达和P14ARF基因的过度甲基化有关。

p14ARF基因联合氟尿嘧啶对人结肠癌LOVO细胞的作用

目的观察p14ARF基因转染联合氟尿嘧啶对人结肠癌LOVO细胞的作用。方法采用RT-PCR和Western blot方法检测转染前后LOVO细胞中p14ARF基因的表达。四唑蓝比色法(MTT法)检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,对比在不同浓度的氟尿嘧啶作用下转染前后LOVO细胞的增殖情况。结果LOVO细胞呈现p14ARF基因缺失变异。RT-PCR和Western blot法证实转染后LOVO细胞中有p14ARF基因的表达。p14ARF基因转染后细胞增殖受抑,流式细胞仪显示p14ARF基因诱发凋亡。在氟尿嘧啶0.1g/mL的作用下,未转染的LOVO细胞的增殖速度未受影响,而转染后LOVO细胞较未用药时的抑制率增加;氟尿嘧啶1、10、100μg/mL时,对转染前后LOVO细胞均有增殖抑制作用,且呈剂量相关性。氟尿嘧啶对转染后LOVO细胞的抑制率明显高于未转染的LOVO细胞。结论p14ARF基因转染可抑制LOVO细胞增殖。p14ARF基因和氟尿嘧啶联合用于LOVO细胞能够加强氟尿嘧啶的增殖抑制作用,明显提高LOVO细胞对氟尿嘧啶的敏感性。

膀胱移行细胞癌组织基因的P14ARF、DAPK、RARβ甲基化变异分析

目的通过检测新鲜冰冻膀胱癌组织中P14ARF、DAPK、RARβ基因的启动子CpG岛基因的甲基化状态,探讨P14ARF、DAPK、RARβ在膀胱癌发生过程中的作用及诊断意义。方法采用甲基化特异性PCR技术检测48例手术切除的膀胱癌组织和其中13例相应癌旁组织标本、17例非肿瘤患者正常膀胱组织中DAPK、RARβ、P14ARF基因的甲基化情况。结果 48例膀胱癌组织中发现P14ARF基因异常甲基化13例(27.0%),DAPK基因异常甲基化13例(27.0%);RARβ基因异常甲基化44例(91.6%);17例腺性膀胱炎组织中发现P14ARF基因异常甲基化0例,DAPK基因异常甲基化2例(11.7%);RARβ基因异常甲基化3例(17.6%);13例正常膀胱组织中,仅有2例RARβ基因异常甲基化,P14ARF基因、RARβ基因异常甲基化膀胱癌组织与腺性膀胱炎组织差异有统计学意义(P<0.01;P<0.05)。结论 P14ARF、DAPK、RARβ基因异常甲基化与膀胱癌发病密切相关,RARβ基因可作为正常膀胱组织与癌组织鉴别诊断的标志物。

鼻咽癌组织中P14ARF和P15INK4B基因异常甲基化的研究

目的 通过检测P14肝和P15INK4B基因启动子区甲基化情况,分析其与鼻咽癌发生、发展及临床病理特征的关系,探讨其可能在鼻咽癌临床早期分子生物学诊断和治疗中的作用.方法 运用甲基化特异性聚合酶链式扩增对54例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽上皮组织的P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化状态进行检测,比较两者的差异,并分析鼻咽癌组织中两种基因甲基化与患者临床病理特征的关系,以及两种基因甲基化的相关性.结果 鼻咽癌组织中P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化阳性率分别为20.4%(11/54)和22.2%(12/54),两者总检出率为27.8%(15/54);而正常鼻咽上皮组织中未检测到P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化;两组间P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化阳性率差异有统计学意义(P<0.01).15例甲基化的癌组织同时两种基因同时甲基化为8例,非甲基化39例.P14ARF和P15INK4B基因甲基化与鼻咽癌的临床病理特征均无明显相关性(均P>0.05).结论 P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化在鼻咽癌的发生、发展中可能存在协同作用,作为鼻咽癌发生的早期事件,有望成为分子生物学早期诊断的标志物,将来还可能作为去甲基化基因治疗的靶点.

非小细胞肺癌中p14^(ARF)基因的表达及意义

①目的检测p14ARF基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达情况,并探讨其在NSCLC发生、发展过程中的作用。②方法应用蛋白印迹方法检测了28例NSCLC组织标本p14ARF蛋白的表达水平。③结果肺鳞癌和肺腺癌中p14ARF蛋白阳性率分别为61.5%和80.0%,与癌旁正常组织(100%)比较差异有显著性(χ2=12.27、6.02,P<0.05);p14ARF表达异常与肿瘤分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移情况无显著相关性;p14ARF蛋白在Ⅰ期病例中强阳性占阳性比例为62.5%,在Ⅲ期病例中强阳性占阳性比例为16.0%。④结论p14ARF基因在NSCLC发生、发展过程中起重要作用,特别在肿瘤早期可能起更为重要的作用。

皮肤鳞癌组织中E-Cadherin,p14ARF,P16INK4a基因启动子甲基化检测及其意义

目的通过检测皮肤鳞癌组织及正常皮肤组织中E—cadherin，p14ARF，P16INK4a基因启动子甲基化的发生情况，探讨E-cadherin，p14ARF和P16INK4a基因启动子甲基化在皮肤鳞癌发生发展中的作用。方法采用酚-氯仿法提取30例皮肤鳞癌组织及正常皮肤组织的基因组DNA，应用甲基化特异性PCR对所提DNA进行E-cadherin，p14ARF和P16INK4a基因甲基化检测。结果癌组织中E-cadherin，p14ARF和P16INK4a基因启动子甲基化的阳性率分别为36．7％（11／30），60．0％（18／30）和53．3％（16／30），而正常皮肤组织中相应的3个基因的甲基化率分别为10．0％（3／30），6．7％（2／30）和6．7％（2／30），均显著低于癌组织。结论皮肤鳞癌中P16INK4a基因启动子甲基化与正常皮肤组织有明显差异，且在低分化癌中更多见；E-cadherin基因启动子甲基化与正常皮肤比较有显著差异，并且有淋巴结转移多见的显著特征，皮肤鳞癌中p14ARF基因甲基化发生率明显高于正常皮肤，且与分化程度、淋巴结转移和临床分期有关系，同时p14ARF，E-Cad-herin，p16INK4a三种基因甲基化存在正相关关系，这3个基因的甲基化位点与皮肤鳞癌密切相关。

虎杖苷调节Akt/MDM2/p53信号通路对胆囊癌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响

目的探讨虎杖苷(PD)调节蛋白激酶B/原癌基因MDM2/抑癌基因p53信号通路对胆囊癌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响。方法以人胆囊癌细胞株(GBC-SD)为研究对象,体外培养人胆囊癌细胞株(GBC-SD),使用浓度为10~160 mmol/L的虎杖苷处理细胞24、48、72 h,采用CCK-8法检测细胞的增殖能力,确定最佳实验浓度。将GBC-SD细胞分为对照组(Control组)、虎杖苷低、中、高浓度组(PD-L组、PD-M组、PD-H组)、虎杖苷+Akt激活剂组(PD+SC79组),Transwell小室法评价细胞的迁移能力,Hoechst染色观察细胞的凋亡,流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡,Western blot检测Akt、MDM2、p53磷酸化水平,建立荷瘤小鼠模型评价虎杖苷对胆囊癌肿瘤生长的影响。结果浓度为10~160 mmol/L的虎杖苷处理细胞24 h,可显著抑制GBC-SD细胞的增殖活性,选择10、20、40 mmol/L的虎杖苷进行后续实验;与Control组比较,PD-L组、PD-M组、PD-H组GBC-SD细胞的迁移数、细胞凋亡率、G2/M期细胞比例及S期细胞比例、P-Akt、P-MDM2蛋白表达显著降低,G0/G1期细胞比例、P-p53蛋白表达显著升高,且呈浓度依赖性(P<0.05);与PD-H组比较,PD+SC79组GBC-SD细胞的迁移数、细胞凋亡率、G2/M期细胞比例及S期细胞比例、P-Akt、P-MDM2蛋白表达显著升高,G0/G1期细胞比例、P-p53蛋白表达显著降低(P<0.05);虎杖苷干预治疗后,小鼠移植瘤的生长速度显著降低(P<0.05)。结论虎杖苷可以通过调节Akt/MDM2/p53信号通路使细胞周期阻滞,抑制胆囊癌细胞增殖、迁移。

p14^(ARF)基因在肺癌中的表达及意义

目的:探讨p14ARF基因在肺癌中的表达及意义。方法:采用免疫组化S-P法,检测60例肺癌及20例正常肺组织中p14ARF蛋白的表达情况。结果:p14ARF在肺癌组织中的阳性率为43.3%,显著低于正常肺组织的95%,两组间差异有显著性(P<0.05);p14ARF与肺癌患者的性别、年龄、组织学类型、分化程度及淋巴结转移等无相关性(P>0.05)。结论:p14ARF的表达缺失在肺癌的发生发展中起重要作用,可作为肺癌基因诊断和治疗的靶点。

p14ARF基因在大肠癌中的表达及意义

目的:探讨p14ARF基因在大肠癌中的表达及其生物学意义方法:应用免疫组织化学(S-P)法和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术原位观察60例大肠癌患者的癌组织、癌旁组织和正常组织中p14ARF基因蛋白的表达和细胞凋亡. 结果:癌组织p14ARF基因的阳性表达相对含量(PU)(9.57±1.03)明显低于癌旁(28.17±5.26,t=2.51,P=0.02<0.05)和正常组织(43.76±7.14,t=3.61,P=0.006<0.01);癌旁凋亡指数(AI)(8.51±2.63%)高于癌组织凋亡指数(AI)(5.65±1.76%, t=2.18.P=0.04<0.05);p14ARF基因蛋白的阳性表达按患者的性别、年龄、肿瘤大小分组比较各组间无明显区别; 按癌组织的分化程度、淋巴结转移和Dukes分期比较,低分化组、有淋巴结转移组和Dukes C+D期组的p14ARF基因蛋白表达分别低于高分化组(7.93±1.89 vs 12.76±2.28, t=2.36,P=0.03<0.05)、无淋巴结转移组(7.21±1.95 vs 13.12±2.33.t=2.34,P=0.03<0.05)和Dukes A+B期组(7.87±1.18 vs 12.03±2.15,t=2.36,P=0.03<0.05). 结论:p14ARF基因在大肠癌组织中表达下调,从而抑制大肠癌的细胞凋亡,这可能是大肠癌发生、发展的机制之一; p14ARF基因的表达下调与大肠癌的恶性生物学行为有关.