P16^INK4A基因对宫颈癌和癌前病变的诊断价值

目的探讨宫颈癌及癌前病变(CIN)组织中P16INK4A基因表达的临床意义及P16INK4A基因检测对宫颈癌及CIN的诊断价值。方法选取2004—2006年经病理检查证实的宫颈浸润癌患者18例、CIN患者150例和慢性宫颈炎患者57例,采用EnVision免疫组化法检测组织标本中P16INK4A阳性表达情况,并进行比较分析。结果CIN组和浸润癌组患者的P16INK4A阳性表达率与慢性宫颈炎组间差异均有统计学意义(P<0·01);随宫颈病变程度加重,P16INK4A的表达强度和阳性表达率不断升高(P<0·01)。结论P16INK4A基因表达与宫颈癌及CIN病变程度及其进展有关;P16INK4A基因可作为宫颈癌和CIN早期诊断、判断病情、预测病情进展和预后的生物学指标。

食管鳞癌中hMLH1、E-cadherin、p16^INK4a基因启动子甲基化及其意义

背景与目的:目前认为抑癌基因启动子甲基化导致转录抑制是恶性肿瘤发生的重要机制之一,hMLH1、E-cadherin及p16INK4a基因在多种恶性肿瘤中都已被证实存在较高频率的甲基化。本研究通过检测食管鳞癌组织及癌旁组织中hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因启动子甲基化的发生情况,探讨hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因启动子甲基化在食管鳞癌发生发展中的作用。方法:采用酚-氯仿法提取105例食管鳞癌组织及癌旁组织的基因组DNA,应用甲基化特异性PCR对所提DNA进行hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因甲基化检测。采用EnVison免疫组织化学二步法对癌组织中上述3种基因蛋白表达进行检测。结果:癌组织中E-cadherin、hMLH1、p16INK4a基因启动子甲基化的阳性率分别为57.1%(60/105)、20.9%(22/105)和50.5%(53/105),而癌旁食管组织中相应的3个基因的甲基化率分别为10.5%(11/105)、1.9%(2/105)和7.6%(8/105),均显著低于癌组织。E-cadherin(P=0.021)及p16INK4a(P=0.026)基因甲基化与蛋白表达缺失密切相关,而hMLH1基因甲基化与蛋白表达无显著相关性。E-cadherin基因启动子甲基化与淋巴结转移有关(P=0.016),p16INK4a基因启动子甲基化与低分化癌有关性(P=0.024)。hMLH1基因甲基化与各项临床病理特征均无关。结论:食管鳞癌中p16INK4a基因启动子甲基化与相应蛋白表达缺失密切相关,且在低分化癌中更多见;E-cadherin基因启动子甲基化与相应蛋白质表达缺失有相关性,并且有淋巴结转移多见的显著特征,这2个基因的甲基化位点与食管鳞癌密切相关。hMLH1基因甲基化可能并不直接参与食管鳞癌的发生、发展。

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰成肌细胞移植对心肌梗死大鼠心肌细胞胰岛素样生长因子Ⅰ及p16^INK4a和细胞核增殖抗原表达的干预

目的:检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后,心肌梗死大鼠心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ含量的变化,以及心肌细胞细胞核分裂抑制因子p16INK4a和细胞核增殖抗原蛋白的表达。方法:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞、未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞均由实验室前期制备。健康雄性SD大鼠90只,取12只作为假手术组,剩余大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,结扎后24h存活36只,随机分为对照组和实验组,18只/组。造模后24h,实验组在动物后肢局部分多点注射总量为0.1mL的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞悬液,(2~4)×1010L-1细胞;对照组和假手术组给予等量未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞悬液。应用ELISA法检测血浆和心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,免疫组化染色检测心肌细胞细胞核分裂抑制因子p16INK4a、细胞核增殖抗原蛋白的表达。结果:①细胞移植后1,2,4周,假手术组血浆和心肌组织内鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的表达无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,实验组和对照组血浆中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度均显著降低(P<0.01),心肌组织中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的含量均明显升高,于第2周达峰值(P<0.01),且实验组较对照组升高更为显著(P<0.01)。②细胞移植后1,2,4周,假手术组和对照组大鼠血浆和心肌组织内均未检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达;实验组于第1周即表达人胰岛素样生长因子Ⅰ,含量显著高于其余两组(P<0.01)。③细胞移植后1周对照组p16INK4a阳性细胞达峰值,显著高于其余2组(P<0.01),然后迅速降低;第2,4周实验组p16INK4a阳性细胞率与假手术组基本相似(P>0.05)。④细胞移植后第1周,实验组细胞核增殖抗原阳性细胞达峰值,显著高于其余2组(P<0.01),随时间延长明显减少;第2周对照组与假手术组细胞核增殖抗原阳性率基本相似(P>0.05),而实验组仍显著高于假手术组,并持续到第4周(P<0.01)。结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死大鼠体内1周后,能有效合成和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ,明显抑制心肌梗死早期心肌细胞p16INK4a表达,同时还可以促进细胞核增殖抗原表达,在局部持续1个月发挥促进细胞增殖的作用。

p16^INK4a基因及其抑制基因Bmil在不同年龄人角膜内皮细胞中的表达及其意义

背景p16^INK4a基因在细胞老化和早衰过程中发挥着重要作用，是目前已知的细胞衰老的主导基因。角膜内皮细胞（CECs）周期停滞于G。期且体内缺乏增生能力，是否与细胞衰老有关尚未得知。目的探讨不同年龄的正常人CECs中p16^INK4a基因及其抑制基因Bmil的表达。方法收集临床上DX液保存的行角膜移植手术后剩余的供体周边环状角膜组织，记录供体年龄。经锥虫蓝一茜素红双染法观察CECs的活性；行苏木精一伊红染色以证实角膜材料的组织结构正常。将收集到的角膜环材料按照年龄分为〈30岁组、30～50岁组和〉50岁组，每组30个角膜环，其中15个用于总RNA提取，另外15个角膜环等分为3份，分别用于免疫组织化学检测、免疫荧光检测和CECs活性的观察。提取每个角膜环的总RNA，行实时荧光定量PCR检测，观察p16^INK4amRNA、BmilmRNA和Ki67mRNA在CECs中的表达。行冰冻切片免疫组织化学染色，检测p16^INK4a、Bmil和Ki67蛋白在CECs中的表达。免疫荧光法检测p16”“。在CECs的表达。结果苏木精一伊红染色结果显示，供体角膜上皮、基质和内皮结构完整，排列规则。实时荧光定量PCR检测显示随年龄增长，p16^INK4a。mRNA的表达增强，而BmilmRNA和Ki67mRNA的表达减弱，差异均有统计学意义（F=5．703，P=0．014；F=3．950，P=0．042；F=548．500，P=0．000），其中与〈30岁组比较，〉50岁组p16^INK4amRNA在CECs中的表达量明显升高，而BmilmRNA和Ki67mRNA的表达均明显降低，差异均有统计学意义（P=0．006、0．013、0．000）。免疫组织化学结果可见，p16^INK4a。蛋白在各组CECs中均有表达，主要位于细胞核内，而Bmil与Ki67在年老供体的表达强度均弱于年轻供体，与实时荧光定量PCR的结果基本一致。免疫荧光染色显示，年老供体CECs p16^INK4a的表达强度强于年轻供体。结论细胞衰老主导基因p16^INK4a的表达随年龄增加而增高，其抑制基因Bmil的表达随年龄增加而降低。

外源基因转染导致小鼠体细胞过快衰老及p16^(INK4a)表达水平变化

对小鼠胎儿成纤维细胞进行外源基因转染时发现,外源基因转染后的小鼠体细胞染色体端粒的长度以每代47 bp碱基缩短;在转染后的衰老细胞中,或细胞随着增龄,p16INK4 5’-调控区DNA甲基化程度逐渐降低;利用RT-PCR与Northern blot证明,衰老细胞与年轻细胞中的p16INK4a基因的表达水平存在显著差异,传代45代的细胞和外源基因转染后的衰老细胞p16INK4a基因的表达水平大约是原代细胞的12～16倍,而原代细胞与20代细胞间的差异很小。外源基因转染后的衰老细胞核移植后能支持克隆胚胎的体外早期发育。

p16、CyclinD1、Cdk4、Rb基因在胰腺癌中的表达及其意义

目的：探讨ｐ１６ 、 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、 Ｃｄｋ４ 、 Ｒｂ 在胰腺癌中的作用及其相互关系。方法：免疫组织化学检测ｐ１６ 、 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、 Ｃｄｋ４ 、 Ｒｂ 蛋白在胰腺癌中的表达，原位杂交检测ｐ１６ 和 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 在胰腺癌中的存在状况。结果：ｐ１６ 在胰腺癌中低表达， Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 和 Ｃｄｋ４ 过度表达，未发现 Ｒｂ 在胰腺癌标本中缺失；ｐ１６ 与 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１，ｐ１６ 与 Ｒｂ 呈负相关关系（ Ｐ＜ ０．０５） ， Ｃｄｋ４ 与 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 呈正相关关系（ Ｐ＜ ０ ．０５） 。结论：胰腺癌发生机制涉及ｐ１６ 、 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、 Ｃｄｋ４ 和 Ｒｂ 调节环路中多个基因的异常，ｐ１６ 低表达和 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 过度表达可能起在胰腺癌发生中起协同作用。

p16^INK4a蛋白在宫颈疾病中的表达特点及其与HPV感染的关系

目的研究伴有高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hr-HPV)感染及无hr-HPV感染的宫颈癌(cervical cancer,CC)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)及宫颈炎中p16INK4a蛋白表达水平的变化及意义,探讨宫颈癌及癌前病变中p16INK4a蛋白表达与HPV感染的相关性。方法应用免疫组化方法检测126例宫颈疾病(CC40例,CIN67例和宫颈炎19例)组织中p16INK4a蛋白的表达,其中,hr-HPV(+)宫颈疾病89例(CC32例,CIN48例和宫颈炎9例),hr-HPV(-)宫颈疾病37例(CC8例,CIN19例和宫颈炎10例),进行半定量分析及统计学检验。结果40例CC中,p16INK4a全部阳性表达;48例hr-HPV(+)和19例hr-HPV(-)CIN中,p16INK4a阳性表达分别为39例和12例;9例hr-HPV(+)和10例hr-HPV(-)宫颈炎组织中,p16INK4a阳性表达均为4例。hr-HPV(+)或hr-HPV(-)宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中p16INK4a蛋白表达水平均依次升高。CC和CIN中p16INK4a蛋白表达与hr-HPV感染相互间无显著相关性(P>0.05)。结论细胞周期抑制蛋白p16INK4a在CC及癌前病变中过表达,且与hr-HPV感染无关,提示p16INK4a蛋白在宫颈癌的发生、发展中所起的作用和作用机制可能与其在其他恶性肿瘤中不同。检测p16INK4a蛋白表达有助于CC的早期诊断。

角质形成细胞增生行为与p16^(INK4a)蛋白表达和基因失活的相关性研究

目的:探讨角质形成细胞(KC)增生行为与p16INK4a蛋白表达及其基因失活的相关性。方法:对20例皮肤鳞状细胞癌、24例基底细胞癌、18例Bowen病、12例光线性角化病以及8例脂溢性角化病共计82例患者中具不同增生行为的KC,分别应用免疫组化检测其p16INK4a蛋白表达;应用聚合酶链反应(PCR)、PCR-单链构象多态性以及PCR-限制性内切酶分析方法分别检测p16INK4a基因外显子1和外显子2的缺失、突变和甲基化。结果:p16INK4a蛋白表达的阳性率和表达强度随着KC恶性程度的增加而降低,基因缺失和甲基化是皮肤癌p16INK4a基因失活的主要方式,p16INK4a蛋白失表达与其基因失活是一致的。结论:p16INK4a基因失活在KC恶性转化中起重要作用;p16INK4a基因有可能成为皮肤癌诊断与治疗的一种新靶位。

小鼠p16^(INK4a)基因位点的结构和功能研究

p1 6INK4a基因的失活与多种肿瘤的发生和发展有联系。通过筛选小鼠基因组文库 ,获得长度为 1 4.5kb的p1 6INK4a基因组DNA片段。对上述 1 4.5kbDNA测序后进行生物信息学分析表明 :该片段包含 3个外显子 ,编码 1个由 1 68个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量的理论计算值为 1 7941 ,有 7个可能的磷酸化位点 ,说明p1 6INK4a蛋白的功能可能受到磷酸化的调控。该DNA片段的非编码区分布着大量短散布元件、长散布元件和简单重复序列 ,这样的结构为转座和同源重组提供了结构基础 ,提示了部分肿瘤细胞中p1 6INK4a基因缺失的可能原因。

紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16^INK4a启动子活性的影响

利用记数法和Brdu脉冲标记法研究了紫龙金对细胞增殖的影响,western blot检测结果表明:紫龙金(3,4mg.mL-1)处理可明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长、提高BGC-823细胞中p16的表达水平.进一步利用含有p16INK4a启动子片段(-967^-165区域)及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16N研究了紫龙金对p16INK4a启动子活性的影响及其作用的分子机制,结果表明,紫龙金可能通过提高p16INK4a启动子活性而促进p16的表达,从而抑制细胞的增殖.

胃癌中p16^(INK4a)和RB基因甲基化状况及其表达

目的 :研究胃癌组织中 p16 INK4a和视网膜母细胞瘤易感基因 (RB)启动子区域的甲基化状况 ,并探讨基因异常甲基化与蛋白表达及其临床病理指标的关系。方法 :采用甲基化特异性PCR方法对 81例胃癌和 10例正常胃黏膜中 p16 INK4a和RB启动子区域甲基化状况进行检测 ,并采用免疫组织化学方法对 p16 INK4a和视网膜母细胞瘤蛋白 (pRb)表达情况进行相应检测。 结果 :胃癌中 p16 INK4a和RB基因的甲基化率分别为 37% (30 / 81)和 4 2 % (34/81) ;胃癌p16 INK4a蛋白和pRb表达阳性率分别为 5 4 % (4 4 / 81)和 90 % (73/ 81)。 10例正常胃黏膜中均未检测到p16 INK4a和RB异常甲基化 ,而且其相应蛋白表达均为阳性。 p16 INK4a甲基化状况与其蛋白表达有相关性 ,但p16 INK4a甲基化状态与肿瘤分化程度、淋巴结转移、性别及年龄均不相关。RB甲基化状态与pRb表达、肿瘤分化程度、性别及年龄无相关性 ,但与淋巴结转移相关。结论 :p16 INK4a和RB异常甲基化是胃癌细胞常见的分子事件 ,可能参与了胃癌的发生发展过程。RB异常甲基化与胃癌淋巴结转移相关 ,提示RB甲基化检测对于分析胃癌淋巴结转移情况可能有一定参考价值。p16 INK4a基因启动子区域高甲基化是其蛋白表达抑制的重要机制。

p16^(INK4a)基因的功能及其调控

p16 INK4a蛋白能抑制CDK4和CDK6的活性 ,使 pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态而能与转录因子E2Fs结合 ,从而抑制DNA的合成 ,阻止细胞由G1期进入S期 .p16 INK 4a的表达受Ets1和Ets2的正调控 ,受Bmi 1的负调控 .p16 INK 4a基因缺失、突变、甲基化、RNA剪接加工错误可导致细胞周期失控和癌变 .应用p16 INK 4a 对某些肿瘤进行基因治疗的研究正在进行中 .

HPV16／18阳性的宫颈尖锐湿疣及癌前病变组织中NF-κBp50和P16^INK4A蛋白表达分析

[目的]探讨NF-κBp50和P16INK4A在HPV16/18型宫颈尖锐湿疣(condylomata acuminate CA)和宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelinal neoplasin CIN)组织中的表达及意义。[方法]应用免疫组织化学LDP法对21例宫颈CA、34例宫颈CIN进行NF-κBp50和P16INK4A表达分析。[结果]NF-κBp50在CA组织中阳性表达于细胞浆,在CIN组织中阳性表达于细胞核,NF-κBp50在CA、CINⅠ、CINⅡ3组间阳性表达强度有统计学意义(P﹤0.05),P16INK4A在CA组织中阳性表达于细胞核,在CIN阳性表达于细胞核与细胞浆,P16INK4A在CA、CINⅠ、CINⅡ3组间阳性表达强度有统计学意义(P﹤0.05)。[结论]HPV16/18阳性CA向CIN转化可能与P16INK4A和NF-κBp50蛋白过渡表达有关;其联合检测可作为辅助诊断CIN的标志物。

毛冠鹿p16^(INK4)基因第二外显子序列分析

采用PCR扩增技术首次克隆毛冠鹿p16 INK4 基因第二外显子 ,DNA杂交和序列分析发现 ,在 30 7个碱基的第二外显子中仅有 5个碱基的差异 ,同源性达 98.4% .p16 INK4 基因的第二外显子是高度保守的区域 。

结直肠癌患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态观察

目的观察结直肠癌(CRC)患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态。方法 CRC患者50例(肿瘤组)、结直肠良性病变者50例(良性组)、健康体检者50例(正常组),采用甲基化特异度PCR的方法检测各组粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检出率,并分析其与CRC临床病理参数的关系。根据肠镜病理诊断结果进行验证,比较粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A单独及联合检测诊断CRC的敏感度和特异度。结果肿瘤组、良性组、正常组粪便p16INK4a基因甲基化检出率分别为74%、28%、14%,MGMT基因甲基化检出率分别为56%、24%、12%,RASSF1A基因甲基化检出率分别为72%、20%、10%,肿瘤组分别与正常组、良性组比较,P均<0.05。p16INK4a基因甲基化状态与CRC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关,MGMT基因甲基化状态与CRC淋巴结转移相关,RASSF1A基因甲基化状态与CRC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关,P均<0.05。三者联合检测诊断CRC的敏感度为95.8%,特异度为83.4%,ROC曲线下面积为0.816(95%CI 0.739%~0.894%)。结论 CRC患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检出率明显高于结直肠良性病变者及健康体检者,联合检测上述指标有助于CRC患者的早期诊断及其生物学行为的判断。

肺癌p14ARF和p16INK4a基因协同表达缺失及其意义

目的 :研究抑癌基因位点INK4a ARF在肺肿瘤细胞中的表达状况 ,揭示p14ARF和p16INK4a协同表达缺失与肺癌发生发展的相关性。方法 :用RT PCR和Westernblot对 6株肺癌细胞 (SPC A 1,Calu 1,H44 6 ,SH77,A5 49,H46 0 )的INK4a ARF基因位点在mRNA、蛋白质水平上进行检测 ,对PCR产物进行纯化和测序分析。结果 :6株肺癌细胞中 ,有 3株细胞 (H46 0 ,Calu 1,A5 49)的p16INK4a基因表达缺失 ,其中 ,Calu 1表达正常p14ARF的mRNA ,而在H46 0和H5 49这两株非小细胞肺癌中 ,p14ARF和p16INK4a发生协同表达缺失。结论 :p14ARF基因与p16INK4a一样 ,是肺肿瘤细胞中的失活靶点之一。揭示了p14ARF缺失导致p5

p16,cyclinD1,cdk4基因在卵巢癌中的表达及其意义

目的 探讨p16,cyclinD1,cdk4在卵巢癌中的表达及其意义。方法 免疫组织化学检测p16,cyclinD1,cdk4蛋白在卵巢癌中的表达 ,原位杂交检测p16和cyclinD1在卵巢癌中的存在状况。结果 p16在卵巢癌中低表达 ,cyclinD1和cdk4过度表达 ;p16与cdk4呈负相关关系 (P <0 0 5 ) ,cyclinD1与cdk4呈正相关关系 (P <0 0 5 )。结论 卵巢癌发生机制可能涉及p16,cyclinD1,cdk4调节环路中多个基因的异常 ,p16低表达和cyclinD1高表达一起在卵巢癌发生中起协同作用。

小鼠胚胎干细胞p16^(INK4a)基因外显子1α打靶研究

在活体水平上 ,小鼠p16 INK4a基因是否具有抑制肿瘤发生和发展的功能是一个悬而未决的问题。利用筛选基因组文库得到的小鼠p16 INK4a基因组DNA片段 ,构建了针对小鼠p16 INK4a 基因外显子 1α的基因打靶载体 ,其短臂为1.5kbEco81Ⅰ AccⅡ片段 ,长臂为 5 .9kbXbaⅠ XhoⅠ片段。打靶载体经线性化和纯化后通过电穿孔转导小鼠R1ES细胞 ,获得 37个G418和Gancyclovir双药抗性克隆。用Southern杂交法对双药抗性克隆进行鉴定 ,获得一个敲除了p16 INK4a基因外显子 1α的阳性ES细胞克隆。