紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16^INK4a启动子活性的影响

利用记数法和Brdu脉冲标记法研究了紫龙金对细胞增殖的影响,western blot检测结果表明:紫龙金(3,4mg.mL-1)处理可明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长、提高BGC-823细胞中p16的表达水平.进一步利用含有p16INK4a启动子片段(-967^-165区域)及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16N研究了紫龙金对p16INK4a启动子活性的影响及其作用的分子机制,结果表明,紫龙金可能通过提高p16INK4a启动子活性而促进p16的表达,从而抑制细胞的增殖.

食管鳞癌中hMLH1、E-cadherin、p16^INK4a基因启动子甲基化及其意义

背景与目的:目前认为抑癌基因启动子甲基化导致转录抑制是恶性肿瘤发生的重要机制之一,hMLH1、E-cadherin及p16INK4a基因在多种恶性肿瘤中都已被证实存在较高频率的甲基化。本研究通过检测食管鳞癌组织及癌旁组织中hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因启动子甲基化的发生情况,探讨hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因启动子甲基化在食管鳞癌发生发展中的作用。方法:采用酚-氯仿法提取105例食管鳞癌组织及癌旁组织的基因组DNA,应用甲基化特异性PCR对所提DNA进行hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因甲基化检测。采用EnVison免疫组织化学二步法对癌组织中上述3种基因蛋白表达进行检测。结果:癌组织中E-cadherin、hMLH1、p16INK4a基因启动子甲基化的阳性率分别为57.1%(60/105)、20.9%(22/105)和50.5%(53/105),而癌旁食管组织中相应的3个基因的甲基化率分别为10.5%(11/105)、1.9%(2/105)和7.6%(8/105),均显著低于癌组织。E-cadherin(P=0.021)及p16INK4a(P=0.026)基因甲基化与蛋白表达缺失密切相关,而hMLH1基因甲基化与蛋白表达无显著相关性。E-cadherin基因启动子甲基化与淋巴结转移有关(P=0.016),p16INK4a基因启动子甲基化与低分化癌有关性(P=0.024)。hMLH1基因甲基化与各项临床病理特征均无关。结论:食管鳞癌中p16INK4a基因启动子甲基化与相应蛋白表达缺失密切相关,且在低分化癌中更多见;E-cadherin基因启动子甲基化与相应蛋白质表达缺失有相关性,并且有淋巴结转移多见的显著特征,这2个基因的甲基化位点与食管鳞癌密切相关。hMLH1基因甲基化可能并不直接参与食管鳞癌的发生、发展。

胃癌中p16^(INK4a)基因启动子高甲基化及其蛋白表达

目的探讨胃癌中p16INK4a基因失活的主要分子机制及其与胃癌发生、发展的关系。方法采用甲基化特异性PCR技术检测62例胃癌和癌旁组织及10例慢性胃炎黏膜p16INK4a基因启动子区CpG岛甲基化状态,用免疫组化EnVision两步法检测p16INK4a蛋白的表达。结果62例胃癌和癌旁组织p16INK4a基因启动子高甲基化率分别为51·6%(32/62)和19·4%(12/62),10例正常对照胃黏膜未发现高甲基化,胃癌组织p16INK4a基因启动子高甲基化率高于癌旁组织和正常对照(P<0·05)。58·1%(36/62)的胃癌组织p16INK4a蛋白表达阴性,其中72·2%(26/36)的病例具有p16INK4a基因启动子的高甲基化,p16INK4a基因启动子的高甲基化与其蛋白失表达密切相关(P<0·05)。结论胃癌中p16INK4a基因启动子的高甲基化是p16INK4a基因失活的主要机制,并可能是胃癌发生中的早期分子事件。

曲古抑菌素A对腺样囊性癌细胞ACC-2增殖及p16^(INK4a)启动子区甲基化、mRNA表达的影响

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人唾液腺腺样囊性癌细胞ACC-2增殖的影响,并分析其对p16^(INK4a)基因启动子区甲基化及mRNA表达的影响。方法:50～800nmol/L范围内不同浓度的TSA作用于体外培养的ACC-2细胞,采用MTT法检测细胞生长抑制率,观察细胞形态变化。应用甲基化特异性PCR(methylation- specific PCR,MSP)、反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和实时定量PCR(real-time PCR)分析不同时间(2、4、8、16、24h)100nmol/L TSA处理前、后ACC-2细胞中p16^(INK4a)基因启动子区甲基化及p16^(INK4a)mRNA表达的变化。采用SAS6.12软件包对数据进行t检验。结果:TSA在50nmol/L浓度即能有效抑制ACC-2细胞的增殖(P<0.05),并使细胞形态发生明显改变,抑制作用呈明显的浓度和时间依赖性。100nmol/L TSA处理ACC-2细胞2～16h后,p16^(INK4a)基因启动子区甲基化消失;处理2～24h后,p16^(INK4a)mRNA表达显著增高。结论:TSA可能通过改变组蛋白乙酰化的水平影响p16^(INK4a)基因启动子区甲基化的水平,使p16^(INK4a)基因表达升高,影响细胞周期,从而有效抑制ACC-2细胞的生长。

p16^INK4a蛋白在宫颈疾病中的表达特点及其与HPV感染的关系

目的研究伴有高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hr-HPV)感染及无hr-HPV感染的宫颈癌(cervical cancer,CC)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)及宫颈炎中p16INK4a蛋白表达水平的变化及意义,探讨宫颈癌及癌前病变中p16INK4a蛋白表达与HPV感染的相关性。方法应用免疫组化方法检测126例宫颈疾病(CC40例,CIN67例和宫颈炎19例)组织中p16INK4a蛋白的表达,其中,hr-HPV(+)宫颈疾病89例(CC32例,CIN48例和宫颈炎9例),hr-HPV(-)宫颈疾病37例(CC8例,CIN19例和宫颈炎10例),进行半定量分析及统计学检验。结果40例CC中,p16INK4a全部阳性表达;48例hr-HPV(+)和19例hr-HPV(-)CIN中,p16INK4a阳性表达分别为39例和12例;9例hr-HPV(+)和10例hr-HPV(-)宫颈炎组织中,p16INK4a阳性表达均为4例。hr-HPV(+)或hr-HPV(-)宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中p16INK4a蛋白表达水平均依次升高。CC和CIN中p16INK4a蛋白表达与hr-HPV感染相互间无显著相关性(P>0.05)。结论细胞周期抑制蛋白p16INK4a在CC及癌前病变中过表达,且与hr-HPV感染无关,提示p16INK4a蛋白在宫颈癌的发生、发展中所起的作用和作用机制可能与其在其他恶性肿瘤中不同。检测p16INK4a蛋白表达有助于CC的早期诊断。

P16^INK4A基因对宫颈癌和癌前病变的诊断价值

目的探讨宫颈癌及癌前病变(CIN)组织中P16INK4A基因表达的临床意义及P16INK4A基因检测对宫颈癌及CIN的诊断价值。方法选取2004—2006年经病理检查证实的宫颈浸润癌患者18例、CIN患者150例和慢性宫颈炎患者57例,采用EnVision免疫组化法检测组织标本中P16INK4A阳性表达情况,并进行比较分析。结果CIN组和浸润癌组患者的P16INK4A阳性表达率与慢性宫颈炎组间差异均有统计学意义(P<0·01);随宫颈病变程度加重,P16INK4A的表达强度和阳性表达率不断升高(P<0·01)。结论P16INK4A基因表达与宫颈癌及CIN病变程度及其进展有关;P16INK4A基因可作为宫颈癌和CIN早期诊断、判断病情、预测病情进展和预后的生物学指标。

HPV16／18阳性的宫颈尖锐湿疣及癌前病变组织中NF-κBp50和P16^INK4A蛋白表达分析

[目的]探讨NF-κBp50和P16INK4A在HPV16/18型宫颈尖锐湿疣(condylomata acuminate CA)和宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelinal neoplasin CIN)组织中的表达及意义。[方法]应用免疫组织化学LDP法对21例宫颈CA、34例宫颈CIN进行NF-κBp50和P16INK4A表达分析。[结果]NF-κBp50在CA组织中阳性表达于细胞浆,在CIN组织中阳性表达于细胞核,NF-κBp50在CA、CINⅠ、CINⅡ3组间阳性表达强度有统计学意义(P﹤0.05),P16INK4A在CA组织中阳性表达于细胞核,在CIN阳性表达于细胞核与细胞浆,P16INK4A在CA、CINⅠ、CINⅡ3组间阳性表达强度有统计学意义(P﹤0.05)。[结论]HPV16/18阳性CA向CIN转化可能与P16INK4A和NF-κBp50蛋白过渡表达有关;其联合检测可作为辅助诊断CIN的标志物。

核因子-κBp50和P16^INK4A在尖锐湿疣皮损中的表达及意义

尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的性传播疾病之一，最常见于HPV6、11型感染。国内外研究表明CA可发生癌变，因此尖锐湿疣与癌变的关系日益受到人们的关注。笔者通过免疫组化方法对尖锐湿疣组织中核因子（NF）-κBp50和P16^INK4A表达进行了研究，以便进一步了解尖锐湿疣的发病机制。

P16^INK4a蛋白表达调控机制及免疫组化染色结果判读

由CDKN2A基因(p16基因)编码的P16^INK4a(简称P16),又称CAKN2A(cyclin-dependent kinaseinhibitor 2A),MTS-1 (multiple tumor suppressor 1),INK4A(inhibitor of CDK4)等,是细胞周期G1/S期检查点(check point)的负性调节因子和重要的抑癌基因。P16-CDK4/6-cyclin D-pRb 通路调控异常则是引起G1/S转换导致肿瘤细胞过度增殖的重要机制。既往认为,编码P16INK4a 蛋白的CDKN2A基因的纯合性缺失(homozygous deletion)、杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)、点突变(point mutation)和启动子超甲基化(promoter hypermethylation)是肿瘤细胞周期异常的主要机制[1,2]。

三氟拉嗪通过诱导p16^INK4a抑制BGC-823细胞增殖

为探索三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)抗肿瘤作用机制,对胃癌BGC-823细胞进行TFP(5、10μmol/L)处理后,利用计数法、BrdU脉冲标记法、Western印迹等方法从细胞形态、细胞增殖、S期细胞百分比以及相关因子表达水平等方面进行分析.结果显示,TFP处理后,细胞形态发生明显改变,细胞增殖受到明显抑制且呈时间计量效应关系;S期细胞比例下降;p16INK4a表达水平升高.为进一步研究TFP诱导p16INK4a表达的分子机制,本实验采用插入p16INK4a启动子片段及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16INK4a(-967～-165 bp),研究了TFP在转录水平对p16INK4a启动子活性的影响.结果表明,TFP能够提高p16INK4a的启动子活性.上述结果提示,TFP通过诱导p16INK4a表达抑制BGC-823细胞增殖.

p16^INK4a基因及其抑制基因Bmil在不同年龄人角膜内皮细胞中的表达及其意义

背景p16^INK4a基因在细胞老化和早衰过程中发挥着重要作用，是目前已知的细胞衰老的主导基因。角膜内皮细胞（CECs）周期停滞于G。期且体内缺乏增生能力，是否与细胞衰老有关尚未得知。目的探讨不同年龄的正常人CECs中p16^INK4a基因及其抑制基因Bmil的表达。方法收集临床上DX液保存的行角膜移植手术后剩余的供体周边环状角膜组织，记录供体年龄。经锥虫蓝一茜素红双染法观察CECs的活性；行苏木精一伊红染色以证实角膜材料的组织结构正常。将收集到的角膜环材料按照年龄分为〈30岁组、30～50岁组和〉50岁组，每组30个角膜环，其中15个用于总RNA提取，另外15个角膜环等分为3份，分别用于免疫组织化学检测、免疫荧光检测和CECs活性的观察。提取每个角膜环的总RNA，行实时荧光定量PCR检测，观察p16^INK4amRNA、BmilmRNA和Ki67mRNA在CECs中的表达。行冰冻切片免疫组织化学染色，检测p16^INK4a、Bmil和Ki67蛋白在CECs中的表达。免疫荧光法检测p16”“。在CECs的表达。结果苏木精一伊红染色结果显示，供体角膜上皮、基质和内皮结构完整，排列规则。实时荧光定量PCR检测显示随年龄增长，p16^INK4a。mRNA的表达增强，而BmilmRNA和Ki67mRNA的表达减弱，差异均有统计学意义（F=5．703，P=0．014；F=3．950，P=0．042；F=548．500，P=0．000），其中与〈30岁组比较，〉50岁组p16^INK4amRNA在CECs中的表达量明显升高，而BmilmRNA和Ki67mRNA的表达均明显降低，差异均有统计学意义（P=0．006、0．013、0．000）。免疫组织化学结果可见，p16^INK4a。蛋白在各组CECs中均有表达，主要位于细胞核内，而Bmil与Ki67在年老供体的表达强度均弱于年轻供体，与实时荧光定量PCR的结果基本一致。免疫荧光染色显示，年老供体CECs p16^INK4a的表达强度强于年轻供体。结论细胞衰老主导基因p16^INK4a的表达随年龄增加而增高，其抑制基因Bmil的表达随年龄增加而降低。

良性前列腺增生组织中P16^ink4a与HST2 mRNA表达情况的初步探讨

目的:探讨衰老基因P16ink4a与长寿基因HST2在BPH组织中的表达。方法:对23例BPH及18例正常前列腺标本,提取总RNA后行RT-PCR,并对BPH、正常前列腺组织标本中HST2和P16ink4a基因表达进行定性及半定量分析。结果:正常前列腺组织与增生前列腺组织中均无HST2 mRNA表达,仅检测出P16ink4a mRNA的表达。半定量分析显示P16ink4a mRNA的表达在正常前列腺组织(0.4868±0.0545)明显高于BPH组织(0.2783±0.0268),差异有显著性(P<0.05)。结论:P16ink4a基因在BPH发病中可能有重要意义,可能是导致细胞衰老逃逸的因素之一。

高危型HPV负荷量与宫颈上皮内瘤样变级别、Ki-67和P16^(ink4a)表达的关系及随访观察

背景与目的:高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌的主要致病原因。HPV负荷量与宫颈癌的关系存在争论,其与肿瘤标记物的关系研究很少。本研究旨在初步探讨高危型HPV负荷量与宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)级别、Ki-67和p16ink4a表达及术后再次出现细胞学异常之间的关系。方法:选择61例CIN患者宫颈组织石蜡标本(CINⅠ8例、CINⅡ12例、CINⅢ41例),免疫组化检测Ki-67、p16ink4a表达。所有患者术前均用第二代杂交捕获法(hybridcaptureⅡ,HCⅡ)检测HPV负荷量,术后进行随访。结果:高危型HPV负荷量与CIN等级、Ki-67和p16ink4a表达之间呈等级正相关(r分别为0.288、0.318、0.336,P<0.05)。经过平均18.5个月的随访,发现6例患者再次出现宫颈脱落细胞学异常,其中5例术前HPV负荷量≥100RLU/PC、<1000RLU/PC,1例≥1000RLU/PC,但术前HPV负荷量与术后再次出现细胞学异常无关(P>0.05)。年龄、产次、组织学诊断、Ki-67与p16ink4a表达强度亦与术后细胞学异常无关。结论:HPV负荷量与CIN进展、细胞恶性程度增高呈正相关。尽管HPV负荷量与术后再次出现细胞学异常无关,但对病毒负荷量>100RLU/PC的患者仍应严密随访。

宫颈上皮内瘤变中p16^(INK4A)和Ki-67的表达

目的探讨p16INK4A、Ki-67和HPV抗原表达及高危型HPV(HR-HPV)检测在宫颈上皮内瘤变(CIN)病理诊断中的意义。方法选取宫颈活检病理确诊为CIN的组织蜡块101例,重新切片,应用免疫组化两步法检测p16INK4A、Ki-67和HPV抗原表达,并取正常宫颈组织50例进行对比研究。同时,应用第二代杂交捕获法对其中25例CIN组织样品进行HR-HPV检测。结果p16INK4A蛋白表达水平在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ级之间差异有非常显著性(P<0.001),其表达水平随着CIN级别的增高而增加,呈现良好的线性相关性(P<0.001);Ki-67蛋白表达阳性细胞多少与CIN分级之间无显著相关性(P>0.05),但其在宫颈鳞状上皮中的位置分布与CIN级别之间却有显著相关性(P<0.05);HPV抗原免疫组化染色阳性反应仅呈现于CIN鳞状上皮表层挖空细胞内,其阳性率在不同级别CIN之间的差异无统计学意义(P>0.05);HR-HPV在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ级的检出率分别为81.8%、80.0%和100.0%,但其检出率在不同级别CIN之间差异也无显著性(P>0.05)。结论p16INK4A和Ki-67染色对CIN的病理诊断和分级具有一定诊断价值,对于CINⅠ级形态结构不典型的病例,HR-HPV的检测结果对病理诊断有辅助意义。

P16^(ink4)cDNA的克隆及序列分析

Ｐ１６ｉｎｋ４ｃＤＮＡ的克隆及序列分析黄长晖邓炜傅继梁（第二军医大学生物教研室，医学分子遗传学开放实验室上海２００４３３）（复旦大学遗传学研究所上海２００４３３）Ｐ１６ｉｎｋ４是ＣＤＫ（ＣｙｃｌｉｎＤｅｐｅｎｄｅｎｔＫｉｎａｓｅ）抑制蛋白家族中的...

非小细胞肺癌p14^(ARF) p16^(INK4a)蛋白共表达及其临床意义

目的:探讨p14ARF、p16INK4a蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达、意义及相关关系。方法:采用免疫组织化学SP方法对103例NSCLC组织中p14ARF和p16INK4a蛋白的表达进行检测。结果:103例NSCLC组织中p14ARF、p16INK4a蛋白表达阴性率分别为70.87%和43.69%,差异有显著性(P<0.01)。其中35例p14ARF、p16INK4a蛋白表达共阴性,共阴性率达33.98%(35/103),鳞癌中共阴性率明显高于其它组织类型(P<0.01)。p14ARF、p16INK4a蛋白表达阴性相互间无显著相关性(P>0.05)。临床Ⅲ+Ⅳ期病例两种蛋白表达阴性率明显高于临床Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)。结论:NSCLC组织p14ARF、p16INK4a蛋白表达共阴性具有明显的组织学类型特异性,两种蛋白阴性表达是各自独立的事件。