p16逆转录病毒载体的构建及其高滴度克隆的杂交筛选

构建多肿瘤抑制基因 p1 6( mts- 1 )的逆转录病毒载体 ,用一种简便的非放射性杂交方法 ,从多个包装细胞克隆中筛选出病毒滴度高的克隆 ,以提高病毒转导效率 .以 p1 6c DNA全长为目的基因 ,构建逆转录病毒载体 p LMSN,非脂质体转染试剂转染兼性包装细胞 PT67,G41 8筛选抗性克隆 ,扩增单个克隆后提取包装细胞上清的病毒 RNA( v RNA) ,以碱性磷酸酶直接标记的目的基因为探针作斑点杂文 ,化学发光自显影法定量测定 ,在短时间内从多个候选克隆中筛选出高产毒的克隆 .为 p1 6基因治疗的实验研究奠定了物质基础 .

人乳头瘤病毒16 E7(HPV16E7)逆转录病毒载体的构建

目的 构建人乳头瘤病毒 16型E7基因片段 (HPV16E7)的逆转录病毒载体。方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段 ,并用酶切、连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上 ,然后再用酶切、测序进行鉴定。通过Genbank的数据库分析软件对HPV16E7进行同源性分析。结果 经酶切分析、测序证明 ,从HPV16cDNA克隆的 30 0bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组 ,HPV16E7基因片段与数据库中的原HPV16cDNA的E7有高度的同源性。结论 构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体 ,为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础。

逆转录病毒载体介导shRNA对人胚胎肾细胞中p53基因的沉默作用

目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人野生型p53基因设计的shRNA被连接在H1启动子的下游,构建含有shRNA的逆转录病毒载体LTRH1-p53,即RNAi表达载体;利用流式细胞术检测逆转录病毒感染HEK293细胞72 h后细胞内P53蛋白水平的变化。结果:成功构建LTRH1-p53载体,该载体感染HEK293细胞后72 h,与感染空病毒载体LTRH1组相比,P53蛋白表达降至空病毒载体LTRH1组的69%(P<0.01)。结论:LTRH1-p53表达载体成功使p53基因沉默,shRNA表达载体的使用为基因功能研究提供有力工具。

人P58.1重组逆转录病毒载体的构建及其在淋巴细胞中的表达

目的构建人P58.1基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在淋巴细胞中的表达。方法由逆转录病毒载体pMSCV介导,将白血病受者的P58.1基因导入健康供者的淋巴细胞中,并用逆转录聚合酶链式反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达。结果测序及BglⅡ、EcoRⅠ双酶切鉴定证实,获得了P58.1基因且已正确插入载体pMSCV。流式细胞仪检测空载体、未转染及重组pMSCV转染供者淋巴细胞的P58.1分子表达率差异有显著性,重组逆转录病毒感染的供者淋巴细胞整合了受者的P58.1基因,且能转录为相应的mRNA并在细胞膜上有P58.1分子表达。结论成功获得P58.1基因并构建重组逆转录病毒载体,该基因已稳定整合入淋巴细胞的基因组中,且获得了表达。

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的 构建并鉴定携带人p5 8 2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法 用PCR技术从pSPORT1-p5 8 2扩增出编码p5 8 2N端 1～ 3 45个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCVneo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果 双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重组逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G418筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3×10 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8 2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论 构建人p5 8 2基因的逆转录病毒载体可行 。

沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒载体的构建

目的构建沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒表达载体。方法查找人p38MAPK cDNA序列,利用软件设计并合成能够形成互补双链并能转录出靶向人p38MAPK基因的短发夹状RNA的两条寡核苷酸序列,退火后连接至线性化载体pSIREN上,获得重组质粒pSIREN-p38MAPK,酶切和测序进行鉴定。结果双酶切重组质粒获得特定的酶切图谱,证实所合成核酸片段的正确重组;测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同。结论成功构建了沉默人p38MAPK基因的重组质粒pSIREN-p38MAPK。

p27^(kip1)基因逆转录病毒载体的构建及其对人胃癌细胞系生长抑制作用的研究

目的 :研究逆转录病毒介导的p2 7kip1基因过度表达对细胞周期和细胞增殖的影响。方法 :构建含人 p2 7kip1基因的逆转录病毒真核表达载体 ,应用脂质体介导法 ,将外源性 p2 7kip1基因转染人胃癌细胞系BGC 82 3,应用Westernblot、FCM等方法 ,检测p2 7kip1蛋白在胃癌细胞内的表达及其对细胞增殖的影响。结果 :获得含人 p2 7kip1cDNA的重组逆转录病毒载体 ,外源性野生型 p2 7kip1基因整合于胃癌细胞并获稳定表达 ,细胞生长速度受抑制 ,同时出现G1期阻滞。结论 :构建的 p2 7kip1重组逆转录病毒能有效介导外源性 p2 7kip1在人胃癌细胞系中高表达 ,抑制细胞增殖 ,为进一步研究以 p2 7kip1为目的基因的肿瘤基因治疗奠定了基础。

新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒16感染和p33^(ING1b)及端粒酶逆转录酶催化亚单位表达的相关性

目的探讨新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞状细胞癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16感染和p33ING1b及端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)表达的相关性。方法采用免疫组织化学方法检测了50例子宫颈鳞状细胞癌(SCC)和34例子宫颈上皮内瘤变(CIN)p33ING1b和hTERT表达情况,PCR法检测HPV16感染情况,并与12例正常子宫颈进行对照。结果对照组、CIN1组、CIN2～3组和SCC组中HPV16感染率分别为0、22.2%、44.0%和74.0%,各组间差异有显著性(x2=26.537,P=0.000);p33ING1b阳性率分别为91.7%、77.7%、68.0%和36.0%,各组间差异有显著性(x2=38.943,P=0.000);hTERT阳性率分别为50.0%、66.6%、88.0%和94.0%,各组间差异也有显著性(x2=48.199,P=0.000)。HPV16感染与p33ING1b表达呈负相关(r=-0.294,P=0.004),与hTERT表达呈正相关(r=0.286,P=0.005);p33ING1b表达与hTERT表达呈负相关(r=-0.361,P=0.000)。结论HPV16感染可能与新疆维吾尔族妇女子宫颈SCC组织中p33ING1b表达下降及hTERT表达增加有关。

含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的:制备含野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法:设计引物PCR扩增野生型p53cDNA,用T-A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109,提取pGEM-T/p53重组体,双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选pL(p53cDNA)SN重组体,脂质体法转染包装细胞AM12,G-418(geneticin)筛选,收集病毒液。结果:通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆,收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论:含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的 构建并稳定携带人p5 8.2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法 用PCR技术从pSPORT1 -p5 8.2扩增出编码p5 8.2N端 1～ 345个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCV neo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT6 7,G4 1 8筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果 双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重线逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G4 1 8筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3× 1 0 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8.2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论 构建人p5 8.2基因的逆转录病毒载体可行 。

逆转录病毒介导的野生型p53基因转入对慢粒多药耐药细胞恶性表型的影响

以Ｋ５６２／ＨＨＴ 细胞为模型，采用重组逆转录病毒载体介导的基因转移技术，将人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ转入该细胞系，研究外源性野生型ｐ５３ 基因在白血病多药耐药细胞表达的意义。结果显示，外源性野生型ｐ５３ 基因抑制细胞增殖，一般形态学观察见细胞明显向成熟型分化。流式细胞仪分析还显示ｐ５３ 基因诱导Ｋ５６２／ＨＨＴ细胞死亡且伴有细胞周期Ｇ１ 期的生长阻滞。结果表明，野生型ｐ５３

逆转录病毒介导的野生型p53基因对原位肺癌的治疗效应

非小细胞肺癌(NSCLC)在所有肺癌中所占比例比较高．达75％-80％．但所有治疗措施中仅10%有一定效果，其它均不能令人满意。随着科学的发展．人们从分子水平上对其发病机理的了解也越来越深刻，并逐渐认识到，这类癌症的发生与多基因的变异有关．其中，p53抑癌基因的突变(如Tp53)在人类肺癌中最为普遍，因此，肺癌细胞中野生型p53功能的恢复有可能抑制肿瘤细胞的生长。本研究观察了表达野生型p53的逆转录病毒载体应用于原位肺癌的治疗效果。

腺病毒介导的p16基因对TJ899细胞系活性的影响

目的 研究五型腺病毒载体 (Ad5 )携带p16基因对恶性脑胶质瘤细胞系TJ899生长状态的影响。方法 免疫组化 (SP法 )测定p16蛋白表达 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法和克隆形成实验测定恶性脑胶质瘤细胞系生长状态。结果 重组体腺病毒能介导p16外源基因在恶性脑胶质瘤细胞系TJ899细胞中阳性表达 ,6d时肿瘤细胞生长抑制率为 93% ,并且能显著地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力。结论 腺病毒介导p16基因能在肿瘤细胞中表达 。

逆转录病毒介导的p16基因对人卵巢癌细胞系生长抑制作用的研究

目的研究逆转录病毒介导的ｐ１６基因对人卵巢癌细胞系ＣＡＯＶ３生长与致瘤性的抑制作用。方法应用脂质体介导法，将外源性野生型ｐ１６基因转染不表达ｐ１６的人卵巢癌细胞系ＣＡＯＶ３，对转染后细胞ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白进行分析并观察其生物学行为变化。结果外源性野生型ｐ１６基因已整合于细胞并获稳定表达，表达有外源ｐ１６基因的细胞生长速度、集落形成率及裸鼠致瘤性均有部分抑制。细胞周期分析可见Ｇ１期增加，Ｓ期下降。电镜下超微结构出现生长抑制特征。结论ｐ１６基因可明显抑制癌细胞生长，在卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用。

p16基因治疗对肝癌细胞生物学行为的影响

背景与目的:p16基因是原发性肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)中失活频率很高的抑癌基因之一,应是治疗HCC的理想靶基因。本研究的目的是探讨转入野生型p16cDNA对肝细胞性肝癌细胞生物学行为的影响。方法:用我们构建的p16基因的逆转录病毒表达载体pcLXSN-p16,分别感染p16蛋白表达阴性与表达阳性的肝癌细胞株SNU-449与HepG2.2.15,筛选出稳定的表达株,对转基因后肿瘤细胞的生物学行为进行观察。结果:p16蛋白表达阴性的SNU-449细胞转入野生型p16基因后,细胞生长速度明显减慢,G0-G1期细胞明显多于转基因前,其裸鼠首次接种成瘤率(可在一定程度上反映瘤细胞对组织的侵袭能力)、在裸鼠体内的生长速度以及对裸鼠的致死性均低于未转基因者。而p16蛋白表达阳性的HepG2.2.15细胞转入外源p16cDNA后,其生长状况及细胞周期则未发现有明显改变。就SNU-449与HepG2.2.15细胞株而言,转入p16cDNA均未能诱导细胞凋亡。结论:转入外源野生型p16基因可抑制p16蛋白表达阴性的肝癌细胞的生长并降低其侵袭能力,但对p16蛋白表达阳性的肝癌细胞的生长则无影响。

稳定表达猪水疱病病毒P1基因的PK-15细胞系的建立

从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK-15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。免疫荧光连续检测阳性克隆传代细胞,发现在不同代次的细胞中均有SVDV P1蛋白表达,而且表达的蛋白可被SVD阳性血清所识别;同时应用PCR技术,可从体外反复传代阳性细胞基因组中扩增到SVD P1基因。表明本次所筛选的阳性细胞克隆不但能持续稳定地表达SVD P1蛋白,而且可携带外源基因进行传代,具有良好的遗传稳定性。

逆转录病毒介导的p16基因治疗原发性肝癌的实验研究

目的 调查转入野生型 p16cDNA对肝细胞性肝癌细胞生物学行为的影响。 方法 构建p16基因的逆转录病毒表达载体 pCLXSN p16,完成病毒包装后 ,分别感染p16表达阴性与阳性的肝癌细胞株 ,并筛选出各自稳定表达株 ,观测转基因后外源P16蛋白的表达及肿瘤细胞的生长情况 ,并检测肿瘤细胞的凋亡与生长周期。结果 我们包装产生的 pCLXSN p16假病毒具有感染肿瘤细胞并表达外源P16蛋白的功能 ,p16表达阴性的细胞SNU 44 9转入野生型 p16基因后 ,细胞生长速度明显减慢 ,G0 ～G1期细胞明显多于转基因前 ,而 p16表达阳性的细胞HepG2 .2 .15 ,转入外源p16cDNA后 ,其生长状况及细胞周期则未见明显改变 ,就SNU 44 9与HepG2 .2 .15细胞株而言 ,转入 p16cDNA均未能诱导细胞凋亡。结论 转入外源 p16基因可抑制P16蛋白表达阴性的肝癌细胞的生长。

体外转染野生型p16-基因对兔血管平滑肌细胞生长的抑制作用

目的 :研究体外转染外源性野生型 p16基因对兔血管平滑肌细胞生长的影响。 方法 :构建野生型 p16基因的重组逆转录病毒载体 ,并体外转染兔血管平滑肌细胞 ,应用 Northern blot及 Westernblot检测外源 p16基因的表达 ,并用四唑盐 ( MTT)法及流式细胞仪检测其对细胞生长的抑制作用。 结果 :逆转录病毒载体可有效地将外源性 p16基因导入平滑肌细胞 ,表达 P16蛋白 ,并显著抑制血管平滑肌细胞的生长使细胞滞留于 G1 期。 结论 :体外转染外源性野生型 p16基因可有效抑制血管平滑肌细胞的生长。