胃癌中p16^(INK4a)和RB基因甲基化状况及其表达

目的 :研究胃癌组织中 p16 INK4a和视网膜母细胞瘤易感基因 (RB)启动子区域的甲基化状况 ,并探讨基因异常甲基化与蛋白表达及其临床病理指标的关系。方法 :采用甲基化特异性PCR方法对 81例胃癌和 10例正常胃黏膜中 p16 INK4a和RB启动子区域甲基化状况进行检测 ,并采用免疫组织化学方法对 p16 INK4a和视网膜母细胞瘤蛋白 (pRb)表达情况进行相应检测。 结果 :胃癌中 p16 INK4a和RB基因的甲基化率分别为 37% (30 / 81)和 4 2 % (34/81) ;胃癌p16 INK4a蛋白和pRb表达阳性率分别为 5 4 % (4 4 / 81)和 90 % (73/ 81)。 10例正常胃黏膜中均未检测到p16 INK4a和RB异常甲基化 ,而且其相应蛋白表达均为阳性。 p16 INK4a甲基化状况与其蛋白表达有相关性 ,但p16 INK4a甲基化状态与肿瘤分化程度、淋巴结转移、性别及年龄均不相关。RB甲基化状态与pRb表达、肿瘤分化程度、性别及年龄无相关性 ,但与淋巴结转移相关。结论 :p16 INK4a和RB异常甲基化是胃癌细胞常见的分子事件 ,可能参与了胃癌的发生发展过程。RB异常甲基化与胃癌淋巴结转移相关 ,提示RB甲基化检测对于分析胃癌淋巴结转移情况可能有一定参考价值。p16 INK4a基因启动子区域高甲基化是其蛋白表达抑制的重要机制。

棕榈酸酯通过调控p16INK4a/Rb信号通路诱导AC16人心肌细胞发生衰老表型改变

目的探讨棕榈酸酯(palmitic acid,PA)在AC16人心肌细胞衰老表型改变中的作用及机制。方法AC16细胞分为(1)对照组PA浓度(0.08、0.19、0.3、0.8 mmol/L)组;(2)对照组,时间(24、36、48、72 h)刺激组。细胞计数试剂盒-8法测细胞总体活性,流式细胞术测细胞周期;活性氧(reactive oxygen species,ROS)试剂盒测细胞内ROS水平;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色测染色阳性细胞率;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno⁃sorbent assay,ELISA)测衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)相关因子白细胞介素(interleukin,IL)-1A、IL-6、IL-8和干扰素(interferon,IFN)-γ浓度;实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)及Western blot测SASP及p16^(INK4a)/视网膜母细胞瘤抑制蛋白(retinoblasto⁃ma protein,Rb)通路表达。为观察p16^(INK4a)/Rb通路对心肌衰老表型影响,细胞分为4组:对照组、PA组、si-con组和si-p16^(INK4a)组,qRT-PCR测p16^(INK4a) mRNA表达;Western blot测p16^(INK4a)、p-Rb、Rb及IL-1A、IFN-γ蛋白表达;β-半乳糖苷酶染色测阳性细胞率。结果随PA浓度及刺激时间增加,细胞活性不断下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,0.19 mmol/L PA组在G1期比例显著升高,S期显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。0.08~0.3 mmol/L PA组ROS水平高于对照组,PA组中β-半乳糖苷酶染色阳性率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。0.19 mmol/L PA组IL-1A、IL-6、IL-8、IFN-γ浓度显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。0.19 mmol/LPA组IL-1A、IL-6、IL-8、IFN-γ及p16^(INK4a)、Rb mRNA及蛋白表达明显高于对照组,而p-Rb蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。si-p16^(INK4a)组IL-1A、IFN-γ蛋白表达及SA-β-Gal阳性率低于si-con组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论0.19 mmol/L PA可能通过调控p16^(INK4a)/Rb通路诱导人心肌细胞衰老表型改变。

CHD5对肺腺癌细胞增殖、凋亡及p16^(INK4a)/RB通路的影响

目的:探讨染色质解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)在肺腺癌(LUAD)中的临床意义及对LUAD细胞增殖、凋亡和p16^(INK4a)/RB通路的影响。方法:通过UALCAN、K-M数据库分析CHD5在LUAD中表达情况及其与预后的关系;通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测LUAD组织、癌旁组织和各细胞系(H1299、H1650、H1975、A549)及正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)中CHD5的表达情况;免疫组化染色检测LUAD组织中CHD5的表达情况,并分析其与患者临床病理特征及预后的关系。CHD5基因的sgRNA载体感染H1975和A549细胞作为过表达组(CHD5-OE组),同时设置空载体感染细胞为阴性对照组(Ctrl-OE组)、未感染病毒细胞为空白组(NC组),并通过CCK-8实验、克隆形成实验、TUNEL凋亡实验、细胞划痕和Transwell实验,评估CHD5表达上调对LUAD细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响,Western blotting实验检测CHD5表达上调对p16^(INK4a)/RB介导的信号通路和细胞周期蛋白表达情况的影响。结果:生物信息数据库分析显示CHD5在LUAD中显著低表达,且CHD5低表达与更差的总生存时间(OS)显著相关;qRT-PCR和Western blotting检测发现,CHD5在LUAD组织和癌细胞(H1299、H1650、H1975、A549)中表达水平均显著低于癌旁组织和正常肺上皮细胞系BEAS-2B,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示,65.7%的LUAD组织样本中CHD5呈低表达或不表达,与临床分期、肿瘤直径及淋巴结转移显著相关,与年龄、性别、吸烟及远处转移无关;CHD5低表达的患者无进展生存期(PFS)更短;Cox多因素分析显示CHD5表达可作为LUAD患者预后影响因素(P<0.001)。CHD5过表达明显抑制体外细胞增殖、迁移和侵袭;CyclinD1、CDK4、p-RB、MMP-9的表达水平降低,caspase-9、p16、RB的表达水平升高;结论:CHD5在LUAD中表达下调且与患者的不良预后相关,CHD5过表达可抑制LUAD细胞增殖、迁移及侵袭,其作用机制可能与抑制p16^(INK4a)/RB信号通路活化有关。

睾酮对衰老心肌细胞及细胞周期调控因子的作用

目的探讨不同剂量睾酮对心肌细胞衰老的干预作用及其可能机制。方法用1μmol/L、100nmol/L、10nmol/L三种剂量睾酮干预自然衰老的小鼠心肌细胞,应用流式细胞仪检测各组细胞周期分布,用RT-PCR及Western印迹检测各组细胞p16INK4a、cyclinD1mRNA、蛋白及去磷酸化RB蛋白的表达。结果与衰老心肌细胞相比,1μmol/L、100nmol/L、10nmol/L睾酮干预细胞G0/G1期比例明显降低(P<0.05),这一作用具有剂量依赖性。睾酮干预可上调cyclinD1mRNA及蛋白表达,下调p16INK4amRNA及蛋白表达,并使去磷酸化RB蛋白表达下降(P<0.05),而这些作用均可被雄激素受体阻断剂而不被雌激素受体阻断剂所阻断(P<0.05)。结论睾酮可剂量依赖性的抑制小鼠心肌细胞衰老,这一作用部分是通过睾酮上调cyclinD1表达,下调p16INK4a及去磷酸化RB蛋白表达而实现的。