非洲猪瘟病毒p17蛋白的哺乳动物细胞表达及鉴定

研究旨在利用哺乳动物细胞悬浮培养系统表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p17蛋白,纯化并免疫小鼠,制备针对ASFV p17蛋白的特异性多克隆抗体。根据GenBank中公布的ASFV SY18毒株p17蛋白编码基因序列,设计特异性引物扩增p17基因片段,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-p17-strep。将其瞬时转染293i细胞,并利用下游strep标签进行蛋白纯化。纯化后的重组p17蛋白配合MnJ(β)胶体锰佐剂免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。利用Western blot、间接免疫荧光试验鉴定该多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示:本试验成功构建pCDNA3.1-p17-strep真核表达质粒,转染293i细胞后纯化获得重组p17蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体与真核表达的p17蛋白及表达ASFV p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒均有良好的特异性免疫反应。本试验为深入探讨ASFV p17蛋白的生物学功能奠定了基础。

禽呼肠孤病毒蛋白p17互作蛋白的筛选与鉴定

禽呼肠孤病毒(ARV)p17蛋白在诱导细胞自噬和促进病毒复制中发挥重要作用,但与宿主细胞之间的相互关系及其致病机制尚不清楚。本研究将ARV GX/2010/1株病毒液以10^(4.3)TCID50/0.2 mL通过滴鼻点眼注射感染7日龄SPF鸡。应用Smart^(TM)技术构建该鸡肝组织cDNA文库,且文库滴度达到2.6×10^(7)CFU/mL。以p17为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选得到16个互作候选克隆,经酵母回复验证得到9个阳性克隆并送至测序。通过NCBI和Uniport等在线数据库比对分析得到PRPS2、IFI16、GTPBP4、IGF2BP1等胞内互作蛋白。基因功能分析显示,这些蛋白参与宿主细胞先天免疫反应、RNA的运输与翻译、结合核糖蛋白复合物、细胞粘附与迁移等生物学过程。对这些互作蛋白的深入研究将为进一步了解ARV及其p17蛋白致病的分子机制奠定基础。

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。

禽呼肠孤病毒分离株P10、P17、δ3蛋白基因的表达及抗血清的制备

禽呼肠孤病毒的感染在我国鸡群中非常普遍，它除了可引起鸡传染性关节炎外，还可能引起矮小综合症和免疫抑制等。从鸡群中分离到的不同毒株ARV的毒力差别较大，抗原性也不尽相同。ARV是一种双股RNA病毒，病毒颗粒中的基因组有10个不同的独立节段组成。

禽呼肠病毒P10、P17非结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据GenBank上的禽呼肠病毒（ARV）S1基因序列，设计并合成了一对跨越P10和P17非结构蛋白基因的特异性引物，对13个ARV毒株进行RT—PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示，13个ARV毒株的P10蛋白基因ORF全长均为297bp，编码98个氨基酸；P17蛋白基因ORF全长为441bp，编码146个氨基酸。这13个ARV毒株P10、P17蛋白基因核苷酸同源性分别在96．6%～100%和95．2％～99．3%之间，推导的氨基酸同源性分别在98．2％～100%和91．9%～99．0%之间。将这13个ARV毒株与Gen Bank上其他正呼肠病毒毒株，包括番鸭株（DRV）和飞狐上分离到的内尔森海湾病毒（Nelson Bay Vir US，NBV）及两个澳洲分离株（ARM—1和SOM-4）进行同源性比较和遗传进化树分析，结果表明，呼肠病毒有地域和种类的差别。

禽呼肠孤病毒σNS和P17非结构蛋白作为ELISA鉴别诊断抗原的研究

表达并纯化了禽呼肠孤病毒(ARV)的2个非结构蛋白σNS和P17,并以此作为包被用抗原,分别进行间接ELISA。结果表明,抗原最佳包被浓度分别为9.3μg/mL和11.5μg/mL;一抗血清的稀释度都是1∶200;HRP酶标二抗羊抗鸡IgG稀释度为1∶5 000,初步建立了能检测ARV感染的σNS-ELISA、P17-ELISA方法。以σNS、P17两种蛋白按以上确定的条件同时包被,建立了σNS-P17-ELISA。分别用σNS-ELISA、P17-ELISA及σNS-P17-ELISA对接种过ARV活病毒或灭活疫苗的33份SPF鸡血清进行检测,结果发现以非结构蛋白建立的3种ELISA方法均能区分ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的抗体,进一步对这3种方法进行敏感性、特异性分析比较,表明σNS-P17-ELISA方法能更有效地区分ARV感染与灭活疫苗免疫抗体。

分离型痘苗病毒表达载体的构建及HIV-1 gag p17-24的表达

目的:探索荧光蛋白作为报告基因以及His·Tag作为纯化标签在重组痘苗病毒表达系统中的应用.方法:将N-端融合His·Tag基因序列,插入痘苗病毒表达载体pSFJ2-16,并在其多克隆位点下游装入带有巨细胞病毒(CMV)启动子的突变型荧光蛋白基因(GFP),构建成N-端融合His·Tag并带有荧光蛋白报告基因的分离型痘苗病毒表达载体.再从pET-28中切出C-端融合His·Tag及多克隆位点序列,并与CMV-FP基因一同装入pSFJ2-16,构建成C-端融合His·Tag的分离型痘苗病毒表达载体.将人免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)核心蛋白(gag)p17-24基因分别插入上述载体,并筛选出重组病毒.结果:实验表明,重组病毒表达了gag蛋白.结论:将His-Tag的纯化标签加入到通用型痘苗病毒表达载体中用于纯化表达的目的蛋白,该方法是可行的.荧光蛋白基因作为一个筛选标记基因应用于痘苗病毒载体系统还有待进行进一步研究.

新短肽P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石材料生物活性的评价

背景:胶原基质矿化磷灰石材料具有仿生的化学组成及良好的生物学性能,已被用于某些骨缺损修复;新短肽P17-骨形态发生蛋白2具有良好的生物相容性和成骨诱导生物活性,因此将新短肽P17-骨形态发生蛋白2与胶原基质矿化磷灰石材料制备成复合支架材料可望提升骨修复效率和效果。目的:探讨新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料的生物活性。方法:将兔骨髓间充质干细胞分别接种于新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料与胶原基质矿化磷灰石材料上,培养3,7 d后,利用RT-PCR检测细胞碱性磷酸酶mRNA相对表达。将新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料(实验组)与胶原基质矿化磷灰石材料(对照组)分别埋置于SD大鼠皮下,植入12,35 d后进行Masson染色后组织学分析。将新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料(实验组)与胶原基质矿化磷灰石材料(对照组)分别植入日本大耳白兔下颌骨箱状缺损处,植入5,15周后进行大体与X射线检查。实验经中国医科大学附属口腔医院伦理委员会批准。结果与结论:①复合材料组培养7 d的碱性磷酸酶mRNA表达高于胶原基质矿化磷灰石组(P<0.05);②皮下埋植实验显示两组材料和组织界面均未引起明显的急性炎症反应,植入后35d实验组可见更多的纤维细胞与材料嵌合;③骨缺损修复实验中,大体观察显示两种材料均具有良好的骨修复能力,植入5周时缺损区已有缩小趋势,植入15周缺损表面比较平整;X射线检查显示与对照组相比,实验组缺损区缩小趋势更明显;④结果表明,新型P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合支架材料具有比胶原基质矿化磷灰石更为优良的生物活性与骨缺损修复能力。

P17-BMP2多肽促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨P17-BMP2对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法体外培养Wistar大鼠BMSCs,分4组培养:对照组(A组)、成骨诱导组(B组)、成骨诱导+P17-BMP2组(C组)、单纯P17-BMP2组(D组)。A组:采用普通DMEM培养基培养;B组:含地塞米松10-7mol/L、Vit C 10 mg/L及β-甘油磷酸钠(β-sodium glycerophos-phate,β-GP)10 mmol/L的DMEM培养基培养;C组:成骨诱导液+P17-BMP2(10μg/mL)培养;D组:含P17-BMP2(10μg/mL)的DMEM培养基培养。CCK-8法检测培养第1、3、5、7天时细胞增殖情况;培养1周后,碱性磷酸酶染色(Alkaline phosphatase,ALP),实时定量PCR检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、转录因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的mRNA表达。结果与A组相比,D组对大鼠BMSCs增殖无影响,而B组对BMSCs细胞增殖具有促进作用,C组细胞增殖能力显著提高;各组碱性磷酸酶染色均为阳性,但染色强度有差异,C组>B组>D组>A组;Q-PCR检测结果显示:与A相比,B组和C组中所有检测基因的表达均显著提高。结论 P17-BMP2能协同成骨诱导剂促进BMSCs的成骨分化。

伤寒沙门菌线性质粒pBSSB1的p17基因的生物学功能分析

H:z66阳性伤寒沙门菌含有一特有的介导鞭毛单向相变换的线性质粒pBSSB1,其上第17号基因(p17)编码一未知功能蛋白(P17)。利用λ-Red系统制备p17基因缺陷变异株,测定变异株和野生株的生长曲线,比较其生长差异,同时通过半固体LB培养基进行动力试验比较其动力差异。利用PCR技术扩增获得p17基因,构建其重组表达载体pET28a(+)-p17,通过镍柱纯化目的蛋白P17-His6,纯化后蛋白作为抗原免疫兔子以制备多克隆抗体。结果显示,制备了p17基因缺陷变异株,变异株的生长明显迟缓于野生株(P<0.05),变异株的动力明显减弱。构建了重组表达载体pET28a(+)-p17,纯化获得了高纯度的目的蛋白P17-His6并制得相应的多克隆抗体。

非洲猪瘟病毒p17蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为研发非洲猪瘟病毒(ASFV)的免疫学诊断试剂,利用杆状病毒表达系统表达了重组ASFV p17蛋白并纯化,然后将其免疫BALB/c小鼠,之后将高血清抗体效价小鼠的脾细胞融合骨髓瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,筛选到16株能稳定分泌抗p17蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的效价均介于1∶2.560×106~1∶1.024×107。抗体亚类鉴定结果显示,6株单克隆抗体(6H6、4D1、7E8、3D1、2F4和2B4)的重链亚类均为IgG1,其余10株单克隆抗体(7H12、10H6、10F3、6E11、4B3、5F7、7H9、6C4、2F1和4H7)的重链亚类均为IgG2a,所有单克隆抗体的轻链亚类均为κ链;IFA鉴定结果表明,共有8株单克隆抗体可特异性识别ASFV。综上,成功制备了ASFV p17蛋白单克隆抗体。

雌激素代谢基因CYP17和COMT单核苷酸多态与子宫内膜腺癌风险的关系

目的:研究参与雌激素合成的细胞色素P450c17(CYP17)和雌激素代谢解毒的儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase,COMT)基因多态与子宫内膜腺癌发生的关系。方法:以病例-对照研究,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法检测80例子宫内膜腺癌患者和84例对照者的CYP17基因转录起始点上游34 bp处的T/C多态及COMT基因第四外显子第158位密码子Val/Met多态。结果:A1/A1、A1/A2、A2/A2三种多态基因型在对照组和子宫内膜腺癌组中的分布差异有统计学意义(P<0.05),其中A1/A1和A1/A2基因型在子宫内膜腺癌组中的分布频率明显高于对照组。子宫内膜腺癌组A1等位基因的分布频率较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05)。与A2/A2基因型相比,A1/A1基因型个体和A1/A2基因型个体发生子宫内膜腺癌的相对危险度(OR)分别是3.152和2.693,其差异均有统计学意义(P<0.05)。COMT基因型频率在对照组和子宫内膜腺癌组中的分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CYP17基因MspAI1位点的A1/A1和A1/A2基因型及A1等位基因与子宫内膜腺癌的发生有关,可作为子宫内膜腺癌易感人群筛查的重要指标,而COMT基因多态性与子宫内膜腺癌风险无相关性。

P17-BMP2联合成骨诱导对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的 探讨P17-BMP2联合成骨诱导对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响。方法 选取9只3周龄Wistar雄性大鼠,分为两组培养,即A组行成骨诱导(含地塞米松7~10mg/L、维生素C 10mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L的DMEM培养基培养),B组成骨诱导+P17-BMP2(成骨诱导液+P17-BMP2 10μg/ml培养),对两组大鼠进行细胞增殖、碱性磷酸酶染色(AKP)及实时荧光定量PCR技术检测,检测两组大鼠骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)及转录因子(Runx2)的mRNA表达,以及测定两组大鼠碱性磷酸酶活性升高情况。结果 培养第5、7天后,B组BMSCs细胞增殖程度明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。诱导第7、14天,B组OPN、OCN、Runx2的mRNA表达均高于A组(P<0.05),诱导第14天,B组碱性磷酸酶活性高于A组(P<0.05)。结论 P17-BMP2联合成骨诱导能够促进骨髓间充质干细胞增殖以及成骨分化,具有较高的可研究性及操作性。

乳腺癌化疗效果与CEP17基因有关

英国研究人员最近发现，一个基因与乳腺癌化疗的效果有关，因此可通过基因测试来帮助确定患者是否适合化疗。

CYP17A1和AR在脑胶质瘤中的表达及意义

目的探讨细胞色素P450c17a酶(CYP17A1)、雄激素受体(androgen receptor,AR)的表达与胶质瘤临床病理之间的相关性。方法应用免疫组化二步法检测55例胶质瘤组织和10例正常脑组织标本的CYP17A1蛋白和AR蛋白的表达情况。结果 1CYP17A1蛋白的表达在高级别胶质瘤和低级别胶质瘤之间具有差异性(χ~2=12.034,P<0.05),而正常脑组织中未见表达。CYP17A1蛋白的表达与病理级别呈正相关(r=0.705,P<0.05)。2AR蛋白的表达在高级别胶质瘤和低级别胶质瘤之间具有差异性(χ~2=19.509,P<0.05),而正常脑组织中未见表达。AR蛋白的表达与病理级别呈正相关(r=0.73,P<0.05)。结论CYP17A1蛋白及AR蛋白在脑胶质瘤组织中表达明显高于正常组织,且CYP17 A1蛋白及AR蛋白在胶质瘤组织中的表达情况与病理级别密切相关,提示雄激素轴在胶质瘤的发生发展中起到了重要的作用。

HIF-1α和CYP17A1蛋白在脑胶质瘤组织中的表达情况及与患者临床特征的关系

目的探讨细胞色素P450c17a(CYP17A1)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在脑胶质瘤组织中的表达情况及与患者临床特征的关系。方法选择88例脑胶质瘤患者的脑胶质瘤组织和44例外伤后实施开颅手术且术后病理学检查无病变患者的正常脑组织,采用免疫组织化学染色法检测HIF-1α和CYP17A1蛋白的表达情况,分析HIF-1α和CYP17A1蛋白表达与脑胶质瘤患者年龄、性别、世界卫生组织(WHO)胶质瘤分级及肿瘤直径的关系。结果脑胶质瘤组织中HIF-1α和CYP17A1蛋白的阳性表达率分别为67.05%和76.14%,均明显高于正常脑组织的6.82%和11.36%,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。WHO分级为Ⅲ~Ⅳ级的脑胶质瘤患者脑胶质瘤组织中HIF-1α和CYP17A1蛋白的阳性表达率均高于WHO分级为Ⅰ~Ⅱ级的脑胶质瘤患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05);不同年龄、性别、肿瘤直径的脑胶质瘤患者脑胶质瘤组织中HIF-1α和CYP17A1蛋白的阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论脑胶质瘤组织中HIF-1α和CYP17A1蛋白的阳性表达率较高,且CYP17A1和HIF-1α蛋白表达情况与脑胶质瘤患者的WHO分级密切相关。

基质蛋白p17在人类免疫缺陷病毒感染及相关性疾病作用中的研究进展

基质蛋白p17是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的一种结构蛋白,不仅在HIV生命周期的多个阶段起着关键作用,还与HIV相关淋巴瘤、神经认知障碍和乳腺癌的发生有着密切关系。本文就基质蛋白p17在HIV感染及相关性疾病中的作用进行综述。

CYP17A1基因新突变致17α-羟化酶／17，20-裂解酶部分性缺陷症

目的 研究1例17α-羟化酶／17，20-裂解酶部分性联合缺陷症患者CYP17A1基因突变特点，并结合患者的临床表现与基因突变类型初步探讨P450C17酶蛋白的结构与功能的关系。方法 收集1例17α-羟化酶／17，20-裂解酶部分性联合缺陷症患者的临床资料及其亲属血标本，提取基因组DNA，设计7对引物扩增CYP17A1基因的8个外显子及外显子与内含子的连接区域，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，产物胶回收后直接做为DNA双链模板测序。DNA双链模板不一致的PCR产物经克隆后测序。测序结果在核苷酸序列数据库进行比较分析。结果 患者CYP17A1基因突变检测结果为5994-5995 delAT／7541C〉T复合杂合子。这两种突变均未见报道。推测5994-5995 delAT导致1259H，274X，突变形成的截短蛋白质缺少血红素结合区域，因此是没有功能的；而通过人类P450C17酶计算机模型分析显示7541C〉T导致的A398V远离酶的活性中心，推测突变可能使酶的活性减弱，而不是完全地丧失。患者临床表现为有自发不规则月经及轻度高血压、低血钾，结合激素测定结果提示肾上腺和性腺保留部分功能。因而患者的基因型与其临床表型是一致的。结论 应进行突变P450C17酶的功能学研究来进一步明确结构改变对功能的影响。

miR-17-5p靶向B7-H3对结直肠癌细胞生物学特性及免疫调节作用的影响

目的:探究miR-17-5p对B7-H3的调控以及在结直肠癌发展中的免疫调节作用。方法:收集25例人结直肠癌组织及相邻正常组织,通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组化实验分析miR-17-5p、B7-H3和PD-L1的表达水平。将人结直肠癌HCT-116细胞分为4组:miR-NC组、miR-17-5p mimic组、si-NC组、si-B7-H3组。通过细胞集落形成实验、Transwell实验和流式细胞术分析HCT-116细胞生长、侵袭能力和凋亡率。通过荧光素酶报告基因实验分析miR-17-5p对B7-H3的调控作用。通过ELISA实验分析细胞培养液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α的细胞因子水平。结果:与癌旁组织比较,结直肠癌组织中miR-17-5p表达下降,B7-H3表达升高。miR-17-5p mimic和si-B7-H3能够降低HCT-116细胞集落形成数量和侵袭数量,促进HCT-116细胞凋亡,并能降低培养液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α水平。此外,miR-17-5p mimic和si-B7-H3能够抑制HCT-116细胞PD-L1表达。结论:miR-17-5p能够靶向抑制B7-H3表达,影响结直肠癌发展中的免疫调节作用,并能抑制结直肠癌细胞的转移,促进结直肠癌细胞凋亡。