巢蛋白在P19神经元分化过程中的表达

小鼠巢蛋白（ｎｅｓｔｉｎ）基因编码了一个中等纤维骨架蛋白，该基因在小鼠中枢神经系统发育过程中瞬时性表达。为了推测该基因在神经发育过程中可能的功能，我们分析了该基因在ＲＡ诱导的Ｐ１９胚胎性癌细胞体外神经分化过程中的表达规律。结果显示，在上述过程中，巢蛋白基因的表达早于神经前体细胞（ｎｅｕｒａｌｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌ）中表达的ＢＭＰ４，以及在成熟神经元中特异表达的标记分子神经丝（ＮＦ１６０），表明巢蛋白基因可能主要在神经干细胞（ｎｅｕｒａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌ）阶段表达。细胞免疫染色结果显示，巢蛋白在神经突及生长锥上存在较强的分布，表明它可能参与了有丝分裂后神经元与靶细胞之间神经联系的建立。

过量表达Wnt-1基因诱导P19细胞的神经分化

Wnt-1基因在小鼠神经发育过程中起着重要作用。该基因在胚胎性癌细胞P19向神经分化过程中存在瞬时性表达。利用克隆到的Wnt－1基因转染P19细胞（Wnt－1／P19），可使细胞不经视黄酸（RA）诱导，自发向神经细胞方向分化。早期神经分化关键基因MASH-1在Wnt－1／P19细胞的神经分化过程中的表达，晚于RA诱导引起的P19细胞的分化过程。

苏云金芽孢杆菌分子伴侣串联基因p19-p29的克隆和表达载体的构建

根据已知序列设计一对PCR引物 (ORF 5S ,ORF 3N) ,可从cry2Aa或cry2Ac操纵子中扩增出包含串联分子伴侣基因p1 9 p2 9的DNA片段 ,预期大小分别为 1 6kb和 2 0kb。对 1 5 0株苏云金芽孢杆菌菌株进行PCR检测 ,从 2 6株中获得了大小为 1 6kb的扩增片段 ,但未获得2 0kb的片段。这表明cry2Aa型操纵子p1 9 p2 9基因存在较广泛 ,而cry2Ac型较罕见。将来自Y2 菌株的 1 6kb片段回收 ,通过一系列亚克隆 ,最终构建成一个含有p1 9 p2 9串联基因的Bt表达载体 ,为进一步研究p1 9 p2

外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化

目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用。方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确。将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d。以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达。结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白。结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化。

应用二甲基亚砜体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的观察P19细胞经二甲基亚砜(DMSO)诱导及不同培养方法,培养形成细胞聚集体并向心肌分化的过程。方法将P19细胞接种于Petri塑料培养皿或铺有0.5%软琼脂的培养皿中,DMSO诱导悬浮培养7 d形成细胞聚集体,将聚集体用生长培养基黏附培养至19 d。观察细胞跳动情况,用-αsarcomeric actinc、ardiac Troponin T(cTnT)抗体进行免疫组织化学染色,鉴定细胞分化。结果经DMSO诱导7d,将形成的细胞聚集体用生长培养基黏附培养至15 d,在聚集体周围的生长晕中出现自发性节律跳动的细胞团片,-αsarcomeric actin及cTnT染色阳性,至19d,阳性率分别可达26%和15%。结论DMSO诱导结合聚集体形成培养方法可诱导P19细胞向心肌细胞分化,并出现自发性有节律跳动。

应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的探讨P19细胞体外经5-氮胞苷(5-aza)诱导向心肌细胞分化的特征。方法将P19细胞接种于铺有琼脂的培养皿中,用含不同浓度5-aza的培养基诱导培养7d,细胞悬浮生长形成类胚体(EBs)。将EBs用生长培养基黏附培养,观察细胞收缩情况;免疫细胞荧光检测α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白(cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、α-MHC基因表达,鉴定细胞分化。结果将5-aza诱导形成的EBs黏附培养后,在EBs周围的生长晕中出现自发性节律收缩的细胞团片,α-sarcomeric actin及cTnT染色阳性,表达GATA-4、α-MHC基因。10μmol/L 5-aza处理组心肌细胞分化率较高。结论5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞向心肌细胞分化,其分化与5-aza浓度有关。

Nkx2-5基因诱导P19细胞分化中心肌标志物的表达

目的研究同源框基因Nkx2-5在心肌发生中的作用。方法实验分转染组和未转染组,转染组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,未转染组细胞为P19细胞。两组细胞悬浮培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4、8、12、16d,免疫细胞化学检测α横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)、心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF)基因的表达。结果转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁的8、12、16d出现表达,表达量有增高趋势;16d与8d比有显著差异(P<0.01);RT-PCR结果显示:转染组GATA-4在贴壁培养的4d有表达,8、12d表达逐渐增多,16d时表达有所下降。α-MHC和ANF在贴壁培养的8d有表达,12d和16d时表达逐渐增多。统计结果表明GATA-4在8、12、16d的表达量与4d比有显著差异(P<0.05或P<0.01),α-MHC在12、16d的表达量与8d比有显著差异(P<0.05,P<0.01),ANF在16d的表达量与8d比有显著差异(P<0.01),16d表达量与12d比也有显著差异(P<0.01);未转染组结果均为阴性。结论外源表达Nkx2-5基因可诱导P19细胞逐渐表达心肌标志物。

pEGFP-C2-GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达

目的:构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C2-GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法:以真核表达质粒pEFSA-GATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEG-FP-C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFP-C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达.结果:酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP-C2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4-EGFP融合蛋白表达.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-C2-GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.

催产素诱导P19细胞分化为心肌细胞的作用

目的研究催产素（OT）在体外诱导P19细胞分化为心肌细胞中的作用。方法将P19细胞用含OT的诱导培养基悬浮培养4d,取其形成的拟胚体（EBs）用不含OT的生长培养基贴壁培养10～12d。用免疫细胞化学、透射电镜等方法对分化的细胞进行鉴定。结果EBs周边生长晕中部分细胞变形、伸长,呈放射状排列。免疫细胞化学染色显示,变形分化的细胞表达α-横纹肌肌动蛋白（α-SCA）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）,并以OT终浓度1×10^-7mol/L的实验组阳性率最高（P〈0.01）。透射电镜观察分化细胞具有心肌细胞发育早期的超微结构特征。结论在体外OT能够诱导P19细胞分化为早期的心肌细胞。

寻常性银屑病皮损及非皮损中IL-23(p19/p40)和IL-12(p35/p40)mRNA的表达

目的检测寻常性银屑病患者皮损及非皮损处IL-23(p19/p40)和IL-12(p35/p40)mRNA表达,探讨其临床意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测寻常性银屑病患者皮损、非皮损处及正常人皮肤中IL-23(p19/p40)和IL-12(p35/p40)mRNA的表达水平。结果寻常性银屑病患者皮损中IL-23p19及p40(IL-23/IL-12)mRNA的表达均高于非皮损组织和正常皮肤组织(P<0.05),且非皮损处高于正常对照组,差异有显著性(P<0.05);IL-12p35mRNA在银屑病皮损处、非皮损处和正常对照中表达水平差异无显著性(P>0.05)。结论在寻常性银屑病发病过程中,IL-23可能发挥较IL-12更重要的作用。

CHD5基因启动子甲基化调控p19Arf/p53/p21Cip1信号通路促进急性髓系白血病发病的研究

目的:探讨急性髓系白血病患者(AML)骨髓中CHD5基因甲基启动子甲基化状态及其调控p19Arf/p53/p21Cip1信号通路促进AML发病的机制。方法:采用MSP检测AML组及对照组CHD5基因甲基化状态,应用实时定量RT-PCR和Westernblot检测CHD5、p19Arf、p53及p21Cip1的表达水平。结果:AML患者骨髓中CHD5基因甲基化率(39.06%)较对照组(6.67%)明显增高(P<0.05);CHD5基因甲基化与AML不同染色体核型相关(P=0.009),但与性别、年龄及临床分型无显著相关(P>0.05);AML患者CHD5相对表达水平明显低于对照组(P<0.05);存在CHD5甲基化AML患者p19Arf、p53及p21Cip1基因和蛋白表达水平较对照组降低。结论:AML患者CHD5基因启动子的高甲基化可导致CHD5、p19Arf、p53和p21Cip1表达水平下降,从而可能通过调控p19Arf/p53/p21Cip1途径减弱对白血病细胞增殖抑制作用,促进AML的发生。

结核分枝杆菌P19对巨噬细胞TLR-2表达及分布的影响

目的探讨结核分枝杆菌19kD脂蛋白(Mtb P19)对单核巨噬细胞表面TLR-2表达的影响。方法以10μg/ml Mtb P19作用于拂波醇酯(PMA)分化的THP-1细胞,CO2孵箱孵育6 h。免疫细胞化学法(ICC)观察巨噬细胞TLR-2分布;对巨噬细胞TLR-2进行荧光抗体染色,流式细胞术分析P19作用前后TLR-2的表达变化;激光共聚焦显微镜观察其受体排列。结果ICC法观察发现TLR-2均匀分布于巨噬细胞表面。P19作用组与对照组相比平均荧光强度明显增强;在作用组细胞表面出现多个斑块状染色阳性的荧光标记区,而对照组TLR-2分子总体呈现随机动态的分布。结论Mtb P19不仅能诱导巨噬细胞TLR-2表达增加,还可以引起受体发生功能性聚集。

苯丙氨酸及其代谢物影响P19细胞神经分化的形态学研究

本研究通过免疫组化及活细胞计数法研究了苯丙氨酸及其代谢物对 P19细胞神经分化的影响。结果显示 :在 P19细胞神经分化诱导期加入苯丙氨酸及其代谢物可降低 P19神经元存活率 ,导致 P19神经元肿胀、崩解 ,神经突起纤细且分支少 ,神经纤维丝蛋白的染色性降低 ,同时发现 P19神经元中多极神经元 /单双极神经元的比例下降。本研究表明 ,苯丙氨酸及其代谢物可影响 P19细胞的神经诱导和分化 。

P19细胞体外DM SO诱导向心肌样细胞分化

目的:体外诱导P19细胞向胚胎心肌样细胞分化.方法:P19细胞经复苏、传代,在体外二甲基亚砜(DMSO)诱导下向心肌细胞分化,分化细胞经HE染色及心肌标志物转录因子(GATA-4),连接蛋白43(connecxin43),α-肌节型肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的免疫细胞化学染色后,在光镜、倒置显微镜下观察细胞形态学变化,透射电镜下观察细胞超微结构变化.结果:经DMSO诱导分化后4 d有细胞聚集体形成,6 d有部分细胞GATA-4和connecxin43呈阳性表达,GATA-4阳性表达位于细胞核和细胞质,connecxin43阳性表达呈斑点状分布于心肌细胞胞质内和细胞膜表面.10 d时GA-TA-4和connecxin43阳性表达明显增加,并有部分细胞呈α-sarcomeric actin阳性,阳性表达位于细胞质.电镜观察,未分化细胞为圆形或椭圆形,细胞间连接松散,细胞质较少,细胞器不发达;诱导后6 d,细胞间出现紧密连接和中间连接,细胞质增多,部分细胞表面出现突起,突起内可见微丝.诱导后10d,线粒体、粗面内质网、滑面内质网、高尔基体丰富,并有中心粒形成.结论:P19细胞在DMSO诱导下已有向心肌分化趋向,有类似胚胎心肌细胞形成.

RNA沉默抑制子p19调控细胞周期相关蛋白表达(英文)

番茄丛矮病毒的P19蛋白不仅是一个重要的病毒致病因子,而且还可作为RNA干扰(RNAi)的抑制子.这种作用是通过限制细胞内的小RNA,比如小干扰RNA(siRNAs)和微RNA(miRNAs)来实现.但是目前对P19蛋白在哺乳动物细胞上的作用还未见报道.构建了一株p19稳定表达的293细胞系,即293-p19.流式细胞仪分析发现在293细胞中过量表达P19蛋白可显著引发细胞周期的G2/M阻滞.细胞增殖实验显示,293-p19细胞的DNA复制及细胞生长均受到显著的抑制.此外,研究还发现p19可使人胚肾293细胞内的细胞周期调控子的表达谱发生改变.其中包括上调cyclinA1,CDK2,CDK4,CDK6,p18,cyclinD2,p19INK4d和E2F1,及下调p15,cyclinA,cyclinB1和cyclinE1的表达.上述研究结果提示,p19有可能靶向多个G2/M调控蛋白从而引发细胞的G2/M阻滞.

P19细胞向神经元诱导分化的实验研究

目的 探讨P19细胞向神经元定向分化发育的可能性。 方法 经维甲酸 (RA)诱导 4d的P19细胞按神经细胞培养方法培养 12d ,分别用NSE、MAP 2和TH进行免疫组织化学染色 ,用AchE进行组织化学染色 ,鉴定分化细胞的特征。 结果 经RA诱导的P19细胞培养 12d ,大多数细胞转变为类似于神经元的形态 ,长出突起并相互联络成网。经NSE免疫组织化学显示 ,12d培养物中神经元约占 89%。P19诱导的神经元培养 12d ,神经元突起经MAP 2染色呈阳性反应。TH免疫组织化学显示 ,神经元中TH染色阳性神经元约占 0 8%。组织化学显示 ,神经元中AchE染色阳性神经元约占 71 0 9%。

细胞衰老的重要通路:p16^(INK4a)/Rb和p19^(ARF)/p53/p21^(Cip1)信号途径

细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制因子p16^(INK4a)、p21^(Cipl)等是细胞衰老的关键效应物。本文对涉及这些抑制物的两条衰老诱导途径作一综述,它们是pl6^(INK4a)/Rb和p19^(ARF)/p53/p21^(Cipl)信号途径。其中,几个抑癌基因的产物Rb、p16^(INK4)a、p53及p19^(ARF)处于两条途径的核心位置。

P19细胞向心肌细胞分化过程中ZNF207基因的表达变化

目的:观察锌指蛋白207基因(ZNF207)在P19细胞向心肌细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨ZNF207基因与心肌细胞分化之间可能的关系。方法:体外培养P19细胞,应用0.9%二甲基亚砜(DMSO)诱导其向心肌细胞分化,采用RT-PCR技术在细胞分化成熟的不同时段检测P19细胞中ZNF207基因mRNA表达水平。结果:ZNF207基因在P19细胞向心肌细胞分化的过程中均有表达,随细胞分化成熟,该基因表达水平逐渐升高。经统计学分析发现,在分化第0～2天该基因表达无差异;第2～10天表达持续性增高,各时间点之间均有差异,差异均有统计学意义(P<0.05);第10～17天该基因稳定高表达,各时间点之间无差异。结论:ZNF207基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中表达逐渐上调,可能有利于心肌细胞的分化和发育。

多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响

目的探讨多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响。方法在P19细胞向心肌细胞分化的培养液中加入多氯联苯(Aroclor 1254)2.5μmol/L,同时设立阴性对照组。显微镜下连续观察P19细胞形态的变化,并采用实时荧光定量RT-PCR技术对分化过程的第0、4、10天中GATA4及Nkx2.5基因mRNA的表达水平进行检测。结果在分化全程(0～10天),实验组与对照组无细胞形态上的差别;而GATA4、Nkx2.5基因的表达量除在分化开始前(第0天)差异无统计学意义外,在分化中期(第4天)及末期(第10天),实验组中GATA4、Nkx2.5基因的相对表达量均显著低于对照组。结论多氯联苯可通过对早期心脏发育相关重要基因的表达影响心肌分化进程。