牛瑟氏泰勒虫P23基因的克隆与生物信息学分析

[目的]为研制牛瑟氏泰勒虫病基因工程苗和诊断试剂盒提供依据。[方法]通过PCR方法从牛瑟氏泰勒虫基因组DNA中克隆了1个P23基因,连接到pGEM-T-Easy载体中。运用生物信息学方法对该基因进行分析。[结果]P23基因全长为684 bp,包含1个长672 bp的开放阅读框,编码223个氨基酸,相对分子量是25.886 kD,等电点pI为9.22,包括1段19个氨基酸组成的信号肽和2段跨膜区。该序列在GenBank上的注册号为EU573168,与瑟氏泰勒虫Chitose型(D84446)和Ikeda型(D84447)的同源性分别为99%、90%。[结论]P23基因编码的蛋白有较好稳定性和免疫原性,可作为制备牛瑟氏泰勒虫基因疫苗的候补抗原。

隐孢子虫P23基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

将隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)P23基因亚克隆到pGEX-4T-1载体中,并用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌诱导表达。以纯化的rP23为诊断抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,观察其敏感性、特异性和重复性,并对临床血清样品进行检测。结果隐孢子虫鼠基因型P23基因在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot检测显示rP23能被隐孢子虫感染兔血清识别。以纯化rP23为诊断抗原,成功地建立了检测兔隐孢子虫病的间接ELISA技术。对23份临床血清检测结果显示,该方法检出率高于Sheather's蔗糖漂浮法、套式PCR法。本研究结果为研制兔隐孢子虫病诊断试剂盒打下了基础。

基于p23基因的野生柑橘和栽培柑橘上衰退病毒分离株间的遗传特征分析

【目的】比较分析野生柑橘与栽培柑橘上衰退病毒(CTV)分离株间的分子遗传特征,为深入解析CTV的遗传进化提供相关依据。【方法】运用RT-PCR对我国云南、广西、四川、湖南、江西等省(区)的11个野生柑橘上的CTV分离株和4个国内栽培甜橙及柚上的CTV强弱毒代表株分离株的p23基因进行扩增、测序,所获序列与Gen Bank收录的具有代表性的国外CTV分离株的相应基因序列进行比对分析。【结果】野生柑橘与国内外栽培柑橘上CTV分离株的p23基因序列相似率为87.7%~99.3%;密码子中碱基含量GC%<AT%,密码子转换数多于颠换数,第3位的碱基替换数最多,其次为第1位,最少是第2位;非同义突变与同义突变的比值(dN/dS)小于1,表明p23基因在进化过程中承受着净化选择。系统聚类分析表明,来自于野生柑橘上的11个CTV分离株在构建的系统发育树中分属不同的簇支,与不同来源地具有较高相似性和较低遗传距离的栽培柑橘上的CTV分离株构成同一组群。【结论】野生柑橘与栽培柑橘上的CTV分离株在碱基含量、密码子转换和颠换率及非同义突变与同义突变比值(dN/dS)等遗传特征方面均表现出一致性,系统发育分析表明,野生柑橘上CTV分离株基于p23基因序列的聚类关系与其地理来源之间无明显相关性。

微小隐孢子虫P23基因在毕赤酵母中的表达及初步应用

为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P23基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增P23基因序列,构建pPIC9K-P23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组P23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-PAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗P23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的P23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。

隐孢子虫不同基因型P23基因的克隆及序列比较

为克隆隐孢子虫不同基因型子孢子表面抗原P23基因,比较其序列差异,提取上海地区分离的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummouse genotype)、隐孢子虫兔基因型(Cryptosporidiumrabbit geno-type)、隐孢子虫猪基因型Ⅱ(Cryptosporidiumpig genotypeⅡ)总RNA,经RT-PCR扩增P23基因,克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,并与GenBank上下载的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)序列进行同源性比对。结果显示,从隐孢子虫3个基因型中均扩增出了P23基因。与微小隐孢子虫P23基因核苷酸序列比较,隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型ⅡP23基因同源性分别为97.6%、97.3%、97.3%,氨基酸序列同源性分别为97.3%、97.3%和96.4%。获得了隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型Ⅱ子孢子表面抗原P23基因。

精神病病人Borna病病毒p23基因片段的检测

为探讨Ｂｏｒｎａ病病毒与人类精神疾病的关系，采用套式逆转录酶／聚合酶链反应技术检测７２例精神病病人和４０名健康献血者周围血单核细胞的Ｂｏｒｎａ病病毒ｐ２３基因片段。结果显示，精神分裂症组的ｐ２３阳性检出率（９．４％）稍高于健康对照组（７．５％），但差异无显著性；双相情感障碍组的阳性检出率（２１．１％）明显高于健康对照组（Ｐ＜０．０５）。提示人类双相情感障碍可能与Ｂｏｒｎａ病病毒感染有关。

微小隐孢子虫p23基因在干酪乳杆菌中的表达及其表达产物的鉴定

应用DNA重组技术把微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)子孢子抗原p23基因克隆入表达载体pMG36e当中,成功构建了可在干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)胞浆中表达的重组载体pMG-p23。并以SDS-PAGE、Western blotting以及IFAT试验方法,分别在破碎菌体组分和活菌体当中鉴定p23基因表达产物并确定其在细胞中表达的位置。本试验为进一步构建分泌型或锚定型干酪乳杆菌(L.casei Zhang)活菌载体奠定了基础。

凡纳滨对虾P23蛋白基因的筛选、表达和生物信息学分析

克隆凡纳滨对虾极端体重个体的组织差异表达基因P23基因并进行生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能以及凡纳滨对虾的分子选育等研究提供信息。以凡纳滨对虾雌虾极端体重个体腹部肌肉为实验材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建极大体重雌性个体和极小体重雌性个体腹部肌肉组织正反向消减cDNA文库:正库(以极大体重个体为试验组,以极小体重个体为驱动组,L-S)和反库(以极小体重个体为试验组,以极大体重个体为驱动组,S-L)消减cDNA文库,并采用实时定量技术分析P23基因的组织表达规律,利用生物信息学对其功能和结构进行预测。以β-actin为看家基因检测两个文库的消减效率分别为210和25,实时定量技术分析结果表明P23基因在体重的调节中起上调作用。P23基因编码区序列全长495bp,编码165个氨基酸,GenBank登录号:JF806619。生物信息学分析发现P23蛋白部分序列含有强疏水性,无跨膜螺旋结构,两种信号肽预测都显示P23含有信号肽。

微小隐孢子虫P23基因真核表达质粒在HeLa细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测

为观察微小隐孢子虫P23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用PCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行P23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-P23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-P23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫P23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-P23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-P23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-P23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫P23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。

牛瑟氏泰勒虫P23和P33表面蛋白双基因融合表达载体的构建及原核表达

为探索牛瑟氏泰勒虫的表面蛋白基因融合产物作为双价疫苗的可行性,以牛瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板,通过重叠延伸拼接聚合酶链式反应(SOE-PCR)把P23和P33表面蛋白基因连接一起,2个基因之间插入一个linker(Gly4Ser)3,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得1151bp的双基因融合片段,克隆于表达质粒pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-P23-P33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小70.0ku的融合蛋白。Western blot检测结果显示,该蛋白与牛瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究此融合蛋白作为疫苗候选成分提供了理论依据。

胃癌p53、c-erbB-2、p21、nm23基因表达的分布特点及其临床意义

目的为探讨手术切除胃癌组织p53、c-erbB-2、p21、nm23联合基因产物表达检测对胃癌诊断治疗及预后判断的价值.方法应用免疫组化技术检测了手术切除胃癌组织p53、c-erbB-2、p21、nm23基因产物表达.结果p53蛋白表达阳性率为36.4%～46.7%,c-erbB-2为33.3%～56.8%,p21为35.1%～56.7%,nm23为30.0%～70.5%.在非胃癌组织中(胃,十二指肠溃疡,胃息肉,重度不典型增生)未见c-erbB-2、p21、nm23基因表达.p53、c-erbB-2、p21的表达与胃癌的分化程度,肿瘤浸润程度,肿瘤转移程度及临床分期呈正相关.nm23的表达与胃癌的分化程度,肿瘤浸润程度,肿瘤转移程度及临床分期呈负相关.p63、c-erbB-2、p21、nm23四种肿瘤蛋白在胃镜活检标本和手术切除标本中表达无显著性差异,胃镜活检标本和手术切除标本检测阳性符合率分别为90.2%、91.0%、93.7%和89.3%.结论对胃癌组织p53、c-erbB-2、p21、nm23基因表达检测在胃部良恶性肿瘤鉴别,非手术临床分期的判断及指导临床治疗等方面具有一定价值.多基因表达检测对胃癌预后判断明显优于单基因表达检测.

猴源人隐孢子虫P23抗原基因克隆表达及其免疫活性的测定

为探索隐孢子虫病免疫预防的新途径,本文对猴源人隐孢子虫Cryptosporidium hominis P23抗原基因进行了克隆、表达及其免疫活性的测定.采用RT-PCR方法对猴源C.hominis P23抗原基因进行克隆,构建重组质粒pGEX 4T 1 P23,并用IPTG诱导其在E.Coli Rossetta中表达;采用SDS PAGE检测其表达效果;采用Dot ELISA和淋巴细胞转化试验分别检测其与抗体反应特性和淋巴细胞增殖情况.结果表明：所克隆的P23抗原基因大小为342 bp;重组质粒表达蛋白的大小为40 kDa（含26 kDa的融合蛋白GST）,以1、5、10 μg剂量的重组蛋白rP23均能刺激鼠脾脏淋巴细胞增殖,并能够与感染猴血清中的抗体明显地发生反应.

牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆与原核表达

构建牛瑟氏泰勒虫P23基因片段原核重组表达质粒,表达重组蛋白。采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因,将扩增产物与pMD18-T-Simple载体连接,测序,验证扩增产物。将P23基因片段克隆到载体pGEX-4T-3上,经酶切分析、PCR鉴定后,IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。结果表明克隆的P23基因片段为684 bp,重组质粒pGEX-4T-3/P23构建成功;SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为58 ku;Western blotting分析结果显示,与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生反应,而与牛瑟氏泰勒虫阴性血清无反应,表明牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白具有良好的抗原性和特异性,提示可以利用融合蛋白来建立检测抗体的间接ELISA诊断方法。

牛瑟氏泰勒虫p23-IL-18融合基因的原核表达

为探索牛瑟氏泰勒虫病基因工程亚单位疫苗的可行性,以p23-IL-18融合基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组质粒pET-28a-p23-IL-18,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,构建牛瑟氏泰勒虫pET-28a-p23-IL-18原核表达质粒,目的基因在大肠杆菌中获得表达,融合蛋白的分子量约为48 kDa,并被牛瑟氏泰勒虫阳性血清所识别,具有良好的反应原性。此结果为牛瑟氏泰勒虫病基因工程亚单位疫苗的制备提供了理论依据。

牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因表达条件的优化

将已构建并测序正确的含有牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的pGEX-4T-P23转化菌用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为46.0 ku的融合蛋白.根据SDS-PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件,结果显示诱导时机和时间是影响表达的主要因素,诱导温度和IPTG浓度次之;确定最佳诱导时机为转接种后2.0 h,最佳诱导温度34℃,最佳诱导时间6.0 h,最适IPTG浓度0.08 mmol/L.表达产物主要以包涵体存在,在优化条件下融合蛋白的表达量经Bandscan5.0软件分析约占菌体总蛋白的31.7%.

大鼠胃癌相关基因p53和p21表达的研究

目的研究中重度异型增生与胃癌发生的关系。方法用免疫组化ＡＢＣ法对相关癌基因ｐ５３和ｐ２１在鼠胃癌发生过程中的表达进行研究。结果中、重度异型增生及胃癌中ｐ５３表达明显高于正常对照组及轻度异型增生，ｐ２１也趋于同样的结果。结论证实中重度异型增生与胃癌的关系，它可作为胃癌的危险信号。

微切割喉鳞状细胞癌9p13-23区域微卫星杂合性缺失的研究

目的 探讨喉鳞状细胞癌 (简称鳞癌 )在 9p13 2 3区域微卫星 (microsatellite)发生杂合性缺失 (lossofheterozygosity,LOH)的热点。方法 采用显微切割法从病理切片中挑取肿瘤组织 ,选取位于 9p13 2 3区域的 13个高多态性微卫星引物对 42例喉鳞癌组织进行聚合酶链反应和变性凝胶电泳。结果 ① 42例喉鳞癌在 9p13 2 3区域等位基因LOH的总发生率是 97 6 %(4 1/ 42 )。在 13个微卫星引物中 ,LOH发生率最高者是位于 9p2 2 2 3的D9S16 2 (89 5 %) ,其次是位于 9p2 1的D9S171(80 0 %)。与p16基因紧密连锁的D9S1748的LOH发生率仅 5 0 0 %。②等位基因缺失作图分析发现 42例喉鳞癌组织在 9p13 2 3上存在 2个明显的LOH较小区域 ,分别位于 9p2 1的D9S16 1～D9S171之间和 9p2 2 2 3的IFNA和D9S16 2之间。结论 喉鳞癌在 9p13 2 3区域除抑癌基因p16以外可能还存在 2个或 2个以上候选抑癌基因 ,这些候选抑癌基因也许和p16一样与喉鳞癌的发生、发展密切相关。

瑟氏泰勒虫p23与牛IL-18复合基因真核表达载体的构建与瞬时表达

为构建瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因真核表达质粒,以pMD-18T-p23和pMD-18T-IL-18克隆质粒为模板,应用重组PCR技术得到瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因,将其先克隆到pMD-18-T载体,再亚克隆到真核表达载体pVAXⅠ中,得到重组质粒pVAXI-P23-IL-18。对该重组质粒进行PCR、酶切鉴定及测序后,采用脂质体法将其转染到BHK-21细胞,用RT-PCR和IFA进行鉴定。结果表明,瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因真核表达质粒pVAXIP23-IL-18构建成功,可在BHK-21细胞中表达。本试验为p23-IL-18复合基因的免疫学研究奠定了基础。

屋尘螨Derp23的克隆表达、纯化及过敏原性鉴定

目的克隆屋尘螨Der p23基因,表达和纯化目的蛋白并进行过敏原性分析。方法提取屋尘螨总RNA,对Der p23基因进行RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)扩增,经限制性内切酶双酶切,酶切产物与表达载体pET-32a(+)重组,转化入感受态大肠埃希菌溶液中。挑取阳性单克隆菌落进行扩大培养,提取目的蛋白并进行Ni2+柱亲和层析纯化,通过Western blot检测其过敏原性。通过BLAST、MEGA、SWISS-MODEL分析重组蛋白Der p23的同源性和三级结构。结果 Der p23基因片段大小约为282bp。大量表达后,SDS-PAGE电泳显示,纯化的重组蛋白Der p23的分子质量单位约为32ku,且以包涵体的形式存在于沉淀物中。Western blot显示该重组蛋白可与尘螨过敏患者血清发生反应,表明其具有过敏原性。BLAST和MEGA分析,Der p23与Der f23的氨基酸序列同源性为77%。Der p23蛋白二级结构主要有β折叠和转角结构,从中预测出5个抗原表位。结论克隆表达和纯化获得了具有过敏原性的Der p23蛋白,为尘螨过敏疫苗和诊断试剂的研制奠定了理论基础。

牛瑟氏泰勒虫二温式PCR快速检测技术的建立及初步应用

为建立一种牛瑟氏泰勒虫快速检测技术,根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因序列(D84447)设计1对特异性引物,扩增出大小为244 bp的基因片段,经克隆、测序分析,与已知基因序列同源性为100%。用该对引物建立的牛瑟氏泰勒虫二温式PCR能检测出的最高敏感度为171 fg/μL,与牛新孢子虫、弓形虫和卵形巴贝斯虫不产生交叉反应,对48份临床血液样本进行检测,阳性检出率为66.67%。用同一对引物对28份临床血液样本分别进行二温式PCR和三温式PCR检测,阳性符合率为95%,总符合率为96.43%。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于牛瑟氏泰勒虫病的快速临床诊断及流行病学调查。