慢病毒载体p24蛋白含量的ELISA检测方法的建立与应用

测定慢病毒载体p24蛋白含量的商业化试剂盒存在成本高、检测线性范围窄和货源可控性差等不足,为解决上述问题,采用由一对鼠抗p24蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体,其中检测抗体进行生物素偶联来建立p24蛋白定量的双抗体夹心ELISA检测方法。通过方阵滴定法确定双抗夹心ELISA实验中的包被抗体与检测抗体的最佳工作浓度。对该方法进行了标准曲线线性范围、定量下限、准确度、精密度、特异性等的考察。取本公司自主研发生产的6个批次的慢病毒载体样品进行p24蛋白定量检测和放置稳定性来考察方法的适用性。实验结果显示,双抗夹心ELISA方法中包被抗体和生物素标记检测抗体的最优工作浓度分别为0.8μg·mL^(-1)和0.005μg·mL^(-1),方法在1.25~80.00 ng·mL^(-1)浓度区间有最佳线性,相关系数r2>0.95。批内和批间检测高、中、低质控品的回收率在80%~120%之间,变异系数均小于10.0%,定量检测下限为1.25 ng·mL^(-1)。同一种慢病毒载体6批次的p24蛋白含量检测结果均在30%偏差范围内,4批次样本放置8 h的稳定性检测结果偏差均在10%范围内。对双抗体夹心ELISA法进行了优化开发和全面验证,旨在提升慢病毒载体p24蛋白含量的定量检测水平,以及为慢病毒载体工艺开发、质量控制和批次之间质量的一致性研究提供重要的数据支撑和理论依据。

HIV-1p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析

合成引物扩增HIV 1p2 4基因 ,并将其克隆到 pQE 30质粒中 ,使其在大肠杆菌E .coliM 15中以IPTG诱导高效表达 ,经SDS PAGE分析 ,该表达产物约占菌体总蛋白 2 0 % ,并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化 ,洗脱产物中 p2 4蛋白纯度达95 %。ELISA分析表明 ,该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B ,亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体 ,用所得抗体与HIV确认试剂反应 ,发现该纯化抗体仅与确认试剂中的 p2 4蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV 1p2 4蛋白 。

在大肠杆菌中高效表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒p24蛋白

为深入研究人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ—１）衣壳蛋白ｐ２４的结构与功能，制备抗Ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原，将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，其产物为３０ｋＤａ的ｓ１０－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组Ｐ２４蛋白均抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ—１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性，对研究开发ＡＩＤＳ诊断试剂和基因工程疫苗具有重要意义。

HIV感染早期病毒p24蛋白的检测

目的:建立敏感、特异的检测血清中HIV-p24蛋白的方法,作为HIV感染早期即窗口期的监测手段。方法:用纯化的p24蛋白免疫小鼠及家兔,获得单克隆及多克隆抗体,经DEAE-52阴离子交换柱纯化后,标记辣根过氧化物酶,建立ELISA双抗体夹心及间接双抗体夹心方法,检测HIV-p24蛋白。结果:包被单抗、标记多抗或包被多抗、标记单抗,均能特异地检出系列稀释的p24蛋白,包被混合单抗较包被多抗更敏感;经标记的抗种属抗体放大可明显提高检测的敏感性。结论:建立了敏感、特异的检测p24蛋白的双抗体夹心法,间接放大方法可检出50pg/mL的HIV-p24蛋白,检测敏感性与国际同类产品相似。

HIV-1 CN54 Gag P55和P24蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的 探讨HIV 1中国株CN5 4GagP5 5和P2 4重组蛋白的高效表达并纯化 ,为研究HIV疫苗和诊断试剂创造条件。方法 分别将CN5 4GagP5 5和P2 4基因克隆至 pBV2 2 0和 pThioHisC载体 ,构建非融合表达载体 ;将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1codonplus RIL ,对工程菌进行诱导表达。Western Blot检测目的蛋白 ,用DEAE SeparoseFF阴离子交换层析柱纯化目的蛋白 ;纯化的P5 5和P2 4抗原蛋白分别包被酶标板作ELISA检测。结果 P5 5以包涵体的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 30 % ,P2 4实现了可溶性表达 ,表达量占总菌体总蛋白的4 0 % ;纯化后P5 5纯度达到 80 % ,P2 4纯度超过 90 %。Western Blot和ELISA检测均显示了良好的的灵敏度和特异性。结论 HIV 1CN5 4GagP5 5和P2 4抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达 ,纯化的抗原蛋白具有良好抗原性 。

HIV衣壳蛋白P24在临床检测中的研究进展

本文就HIV衣壳蛋白P24的生物学特性、免疫反应、检测手段、临床应用及疫苗研究进展等方面进行了阐述,分析了P24蛋白在对HIV研究中的作用及其优缺点。

HIV-1 p24 DNA和P24蛋白联合免疫小鼠的效果

DNA疫苗能够诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫反应,在肿瘤和感染性疾病的疫苗开发中显示出巨大的潜能。以HIV-1核心蛋白P24为抗原基因,构建pVAX1-p24 DNA,经Western blotting和动物活体成像检测证明,pVAX1 DNA携带的外源基因可以在293T细胞和小鼠肌肉组织有效表达。采用不同的免疫策略免疫BALB/c小鼠（DNA/DNA,DNA/Protein）,实验结果表明：pVAX1-p24单独免疫BALB/c小鼠,可诱导明显的体液免疫及细胞免疫反应;pVAX1-p24与P24蛋白联合免疫诱导的体液免疫反应高于pVAX1-p24单独免疫,所获得的抗体滴度是单独免疫的7.3~8.0倍,但细胞免疫反应则不及单独免疫组。研究结果表明采取不同的免疫策略可以诱导产生不同的免疫反应,根据具体情况调整免疫策略将获得更好的免疫效果。这些研究为艾滋病疫苗的研发提供了实验依据。

抗HIV核心蛋白p24单克隆抗体的研制及鉴定

抗ＨＩＶ核心蛋白ｐ２４单克隆抗体的研制及鉴定王宏伟金宁一刘仔郭军庆郭志儒毛春生李萍殷震（解放军农牧大学研究所病毒室，长春１３００６２）人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ１）是导致人获得性免疫缺陷综合征（ＡＩＤＳ）的主要病原［１］。对ＨＩＶ１感染的诊断，常...

嗜人类T淋巴细胞病毒Ⅰ型核心蛋白P24基因的克隆与表达

目的 从感染HTLV-1的中国患者外周血单核细胞（PBMCs）中扩增编码HTLV-1核心蛋白P24的cDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法 提取感染者PBMCs基因组DNA,应用巢式PCR方法扩增出HTLV-1核心蛋白P24的cDNA并测序,与pGEX-20T载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达,采用ELISA和Westernblot分析重组蛋白活性。结果HTLV-1核心蛋白P24基因序列高度保守,构建重组载体后,在大肠杆菌中表达的重组蛋白,经检测具有较强的抗原活性。结论 成功地表达了HTLV-1型病毒的核心蛋白P24基因,为国产诊断试剂和疫苗的研发打下了基础。

弓形虫P24基因编码蛋白的分子生物学研究进展

弓形虫P2 4基因编码的致密颗粒蛋白 (GRA1 )是弓形虫速殖子分泌排泄的抗原之一 ,存在于速殖子与缓殖子的致密颗粒中 ,是弓形虫诊断及制备疫苗的重要分子 ,在人体和动物实验感染中具有较强的免疫原性。本文综述了近年来P2 4 ,即GRA1的分子生物学研究进展及其作为钙离子缓冲剂的功能研究。

TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位研究

目的观察外源性三基序蛋白22(TRIM22)与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位情况。方法分别将pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体转染U-251细胞,通过激光共聚焦显微镜观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1的表达和分布情况。通过激光共聚焦xyz轴扫描,经ImageJ 1.50i软件进行3D结构重建,观察p24-Dsred1在U-251细胞中的分布特点。将pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体在U-251细胞中共表达,观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1是否存在共定位关系。结果单独转染pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP和p24-DsRed1在U-251细胞的胞体或突起中均有较高水平的表达;且3D结构重建显示外源性p24-DsRed1可迁移至U-251细胞的足突。在U-251细胞共转染pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP与p24-DsRed1存在共定位关系,并能以出胞形式脱离细胞。结论 TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中存在共定位关系。

适于HIV-1 p24抗原检测试剂的单抗制备与筛选

目的制备抗HIV-1p24单克隆抗体(单抗,McAb),并利用双抗体夹心ELISA法建立HIV-1p24抗原检测试剂。方法以基因工程原核重组抗原HIV-1p24蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备单克隆抗体,单抗经纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测p24蛋白的最佳配伍单抗以期建立HIV-1p24抗原检测试剂。结果成功筛选到16株稳定分泌抗HIV-1p24单抗的杂交瘤细胞株,并从中筛选出最佳单抗配伍组合“16G12+2F2b-HRP”,该组合对p24蛋白的检测灵敏度为20pg/mL,对感染性克隆pNL4-3表达的HIV病毒培养上清检测呈阳性,对100份HIV阴性人血清无非特异性反应,显示出良好的检测灵敏度和特异性。结论本研究初步成功地建立了HIV-1p24抗原的检测试剂,并为最终建立HIV第四代诊断试剂(HIV Ag/Ab Assay)奠定了坚实的基础。

人免疫缺陷病毒I型 p24gag 基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。

糖皮质激素与炎症因子对应急时相反应蛋白SIP24/24p3的协同调控作用及其意义(英文)

小鼠应急时相反应蛋白SIP24/24p3有抗炎症和特异性诱导白细胞凋亡的功能,其在体内的表达是高度特异性的。为研究 SIP24/24p3的调控因子及机制,我们在小鼠 Balb/cT3和 BNL细胞培养中通过灵敏的^(35)S代谢标记方法检测SIP24/24p3蛋白的表达水平,定量观测分析了糖皮质激素化合物dexamethasone对SIP24/24p3的诱导作用及其与炎症因子白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的协同调控作用。结果显示:(1)在Balb/c 3T3和BNL细胞中,dexamethasone对SIP24/24p3都有明显诱导作用,这种诱导作用在BNL细胞中尤其显著;(2)在Balb/c3T3和BNL细胞中dexamethasone与IL-6协同诱导SIP24/24p3;(3)在Balb/c 3T3细胞中dexamethasone与TNF-α对SIP24/24p3有协同诱导效应,而在 BNL细胞中 dexamethasone与 TNF-α对 SIP24/24p3的诱导表现为相加效应;(4)在 Balb/c 3T3和BNL细胞中 dexamethasone与IL-6/TNF-α对SIP24/24p3的诱导分别表现出协同和相加效应。多种因子对SIP24/24p3的协同诱导调控有助于阐明其在体内的高度特异表达及机制,SIP24/24p3在不同细胞中的不同表达格局也对体内应急时相反应蛋白在肝脏外和肝脏内的表达方式及诱导机制有提示作用。SIP24/24p3能同时被 炎症因子和抗炎症因子诱导的事实显示了其在炎症全过程中的重?

弓形虫P24基因细胞内定位载体重组质粒的构建

目的 构建编码弓形虫 RH株 P2 4基因的细胞内定位载体并进行其序列测定。 方法 弓形虫 RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,Trizol试剂盒抽提基因组 RNA;根据基因库 P2 4基因序列设计合成引物 ,采用 RT- PCR法扩增编码P2 4的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将 P2 4基因定向克隆到细胞内定位载体 p CMV/ myc系列 :p CMV/myc/ cyto(胞质定位 )、p CMV/ myc/ nuc(核定位 )、p CMV/ myc/ mito(线粒体定位 )及 p CMV/ myc/ ER(内质网定位 )。转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞 ,在氨苄青霉素阳性 L B培养基平板上筛选出阳性克隆。重组子经双酶切 ,PCR鉴定 ,最后对重组子进行序列测定。 结果 RT- PCR方法从弓形虫 RH株扩增 5 72 bp的 P2 4基因片段 ,分别构建重组质粒p CMV/ myc/ cyto- P2 4、p CMV/ myc/ nuc- P2 4、p CMV/ myc/ mito- P2 4和 p CMV/ myc/ ER- P2 4 ,酶切和 PCR鉴定产物大小与预期值相符合 ,序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码 P2 4抗原的基因片段。 结论 成功构建编码弓形虫表面抗原 P2 4基因真核细胞内定位载体重组质粒 p CMV/ myc/ cyto- P2 4、p CMV/ myc/ nuc- P2 4、p CMV/ myc/ mito- P2 4和p CMV/ myc/ ER- P2

HIV(1+2)抗体/P24抗原联合法与胶体硒法在临床检测HIV中的应用研究

目的比较第4代酶联免疫吸附测定(ELISA)[HIV(1+2)抗体与P24抗原联合检测]和胶体硒法在临床检测HIV中的特点。方法分别用第4代ELISA检测试剂和胶体硒试剂检测HIV抗体,初筛阳性样本送重庆市疾病预防控制中心进行Western blot确证试验。结果第4代ELISA试剂检测、胶体硒检测及Western blot检测HIV的阳性率分别为0.34%、0.29%及0.27%。第4代ELISA的HIV漏检率(1.3%)低于胶体硒法(4.9%),而其检测HIV的假阳性率(0.03%)高于胶体硒试剂(0.01%)。结论第4代ELISA和胶体硒法联合应用可提高HIV检测的准确性。

基于磁性碳纳米管修饰印刷电极的无酶型HIV p24安培免疫传感器

在多壁碳纳米管(MWNTs)表面固定Fe3O4(核)/Au(壳)纳米微粒(GMP),使其具有超顺磁性,包被p24抗体(anti p24),制得检测探针(MWNTs-GMP/anti p24);在磁场作用下将此探针吸附于N,N'-双(2-羟基苯亚甲基)邻苯二胺合铜(CuRb)修饰的碳基丝网印刷电极(SPCE|CuRb)表面,制得了免疫传感电极(SPCE|CuRb/MWNTs-GMP/anti p24)。当此电极在含p24样本中于室温下温育15min后,随p24浓度的增加在电极表面生成的免疫复合物增加,导致CuRb对H2O2的催化还原电流下降。在含5mmol/L H2O2的PBS(pH7.0)中和-300mV下,催化还原电流降低值ΔIo与p24浓度在0.6～160μg/L呈线性关系;检出限为0.32μg/L(3σ)。将其用于实际样品检测,结果与标准EILSA方法一致。由于MWNTs-GMP/anti p24具有超顺磁性,并可以显著提高电极比表面积及anti p24负载量,而CuRb代替易失活的HRP酶,使得该传感器灵敏度和稳定性俱佳,电极表面可更新,可用于艾滋病人血清中p24筛测。

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及抗原性分析

目的在原核系统中表达全长HIV-1 p24抗原,并对其抗原性进行鉴定。方法利用PCR技术从HIV-1全基因质粒(BH-10)中扩增p24抗原基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达p24抗原。运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳检测插入基因片段的正确性,并用W estern B lot(WB)及ELISA法对表达产物的抗原性进行检测。结果PCR产物和构建的重组质粒pET22b-p24经双酶切插入的外源基因片段均为690 bp,与预期p24抗原全基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE电泳,可见1条相对分子量约26×103的外源表达蛋白带,与预期大小一致,未见杂蛋白带。WB结果显示重组蛋白与HIV-1阳性血清呈特异性反应,与健康人血清没有反应。ELISA检测p24抗原灵敏度为93.94%(62/66),特异性为93.33%(28/30)。结论构建了HIV-1 p24表达载体pET22b-p24,并在原核细胞中高效表达,其表达产物具有良好的抗原性,为研制HIV抗体确认试剂奠定了良好的基础。

TMED2受miR-5583-5p调控在舌鳞状细胞癌细胞中发挥癌基因作用

舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中最常见类型,其发病率和死亡率都较高。大量研究表明,microRNA(miRNA)是一类小非编码RNA,可调节靶基因的转录后处理,导致靶mRNA的降解及翻译抑制。然而,关于跨膜p24转运蛋白2(transmembrane p24 trafficking protein 2,TMED2)受miR-5583-5p调控对TSCC细胞Cal-27迁移、侵袭、增殖及上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)能力影响尚不明确。本研究利用数据库,分析TMED2高表达头颈部肿瘤(head and neck cancer,HNC)病人愈后不良,在HNSCC组织中的表达升高(P<0.001)。Western印迹结果表明,在6例TSCC组织及TSCC细胞系SCC-9、SCC-25和Cal-27中,TMED2蛋白质表达量较癌旁组织及口腔正常上皮细胞中上调,转染TMED2干扰质粒(SiTMED2)的Cal-27细胞中TMED2蛋白质表达量降低,E-钙黏着蛋白(E-cadherin)表达上调,而N-钙黏着蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达下调。迁移与侵袭结果发现,转染SiTMED2的Cal-27细胞穿过小室基底膜细胞数量均低于对照组(P<0.05)。EdU结果显示,转染SiTMED2的Cal-27细胞增殖能力降低(P<0.05)。双荧光素酶结果显示,TMED2存在与miR-5583-5p的结合靶点。荧光定量RT-PCR结果显示,miR-5583-5p在Cal-27细胞中表达量较Hoec细胞中下降,转染过表达miR-5583-5p质粒的Cal-27细胞其表达量升高(P<0.05),过表达miR-5583-5p(miR-5583-5p mimics)后TMED2蛋白表达水平降低(P<0.05)。综上所述,TMED2受miR-5583-5p调控促进舌鳞状细胞癌细胞Cal-27迁移、侵袭、增殖及上皮间充质转化的发生。

TMED5、miR-652-3P在原发性肝癌中的表达及临床价值

目的:分析原发性肝癌(PLC)组织中微小RNA-652-3P(miR-652-3P)和跨膜p24运输蛋白5(TMED5)的表达水平,并探讨其与患者临床病理特征及预后的关系。方法:选取2015年12月至2018年12月行手术治疗的PLC患者82例为研究对象,取手术切除的肝癌组织为观察组,同时选取82例患者手术切除的边缘正常组织(距离癌组织>5 cm)为对照组。采用实时荧光定量PCR法检测所有组织样本miR-652-3P和TMED5 mRNA表达水平,采用Pearson法分析miR-652-3P与TMED5的相关性。分析miR-652-3P和TMED5与患者临床病理特征的关系,Kaplan-Meier分析miR-652-3P和TMED5表达情况与PLC患者生存情况的关系,采用Cox法分析影响PLC患者预后的因素。结果:与对照组组织相比,观察组组织TMED5 mRNA相对表达水平较高(P<0.05),miR-652-3P表达水平较低(P<0.05);PLC组织中miR-652-3P与TMED5呈负相关(P<0.05);miR-652-3P和TMED5与TNM分期、淋巴结转移、淋巴血管间隙浸润相关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度无关(P>0.05);Kaplan-Meier法显示miR-652-3P高表达者平均生存时间显著长于miR-652-3P低表达者,TMED5低表达者平均生存时间显著长于TMED5高表达者;多因素分析表明,淋巴结有转移、miR-652-3P低表达和TMED5高表达是影响PLC患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论:miR-652-3P在PLC组织中表达显著下降,TMED5在PLC组织中表达显著上升,二者水平与淋巴结转移、TNM分期、淋巴血管间隙浸润显著相关,可能是PLC患者预后评估有价值的生物指标。